结肠癌组织RASGRF1蛋白表达与基因甲基化状态变化及其临床意义

钱伟明，王海燕，李可

(常州市武进中医医院，江苏常州213161)

结肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，近年来其发病率和病死率在我国呈明显上升趋势，已成为当今社会严重危胁居民健康的疾病之一[1]。结肠癌早期常无明显症状，多数患者就诊时已属中晚期，即使能够手术，也易出现转移和复发，患者5年生存率较低[2，3]。但目前对结肠癌发病的分子机制仍不十分清楚。Ras超家族是真核生物中普遍存在的一类小分子GTP结合蛋白，通过介导生长因子、细胞因子和多种细胞外信号传导通路，调控细胞的生长、增殖、分化等生物学过程[4]。Ras超家族许多成员是癌基因，其基因突变或蛋白异常表达可导致肿瘤形成[5,6]。Ras蛋白特异性鸟苷酸释放因子1(RASGRF1)是Ras蛋白的上游信号分子之一，能够调控Ras蛋白表达。Deng等[7]研究发现，RASGRF1可作为星形细胞瘤的治疗靶点之一。甲基化是一种重要的表观遗传学修饰方式，特定基因的甲基化可作为恶性肿瘤发生、发展的标志[8]。有研究证实，RASGRF1异常甲基化与胃癌的发生密切相关[9]。但目前鲜见RASGRF1蛋白表达及其基因甲基化状态与结肠癌关系的报道。为此，我们进行了本研究，旨在探讨RASGRF1在结肠癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月～2017年12月常州市武进中医医院收治的初诊结肠癌患者81例。纳入标准：①经术后组织病理检查明确诊断；②初诊，术前未行任何抗肿瘤治疗；③临床病理资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②合并严重影响免疫组化或甲基化特异性PCR(MSP)检查结果的疾病者；③结肠癌组织边界不清，难以取得癌旁非肿瘤组织者；④临床病理资料不完整者。其中，男55例、女26例，年龄29～81岁(<50岁19例、≥50岁62例)；肿瘤直径：<4 cm 38例，≥4 cm 43例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期35例，Ⅲ期39例；组织分化程度：高分化9例，中分化37例，低分化35例；有淋巴结转移45例，无淋巴结转移36例。本研究经常州市武进中医医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

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1.2 RASGRF1蛋白表达检测 采用免疫组化法。取手术切除的结肠癌组织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤组织边缘>5 cm)，常规石蜡包埋，10 μm厚连续切片。切片经65 ℃烤片3 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。Tris-EDTA抗原修复液(pH 9.0)煮沸以修复抗原，自然冷却至室温。PBS冲洗5 min×3次，3% H2O2避光孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性；PBS冲洗5 min×3次，10%正常羊血清封闭10 min，加入兔抗人RASGRF1一抗，4 ℃孵育过夜。次日，PBS冲洗5 min×3次，加入酶标抗兔聚合物二抗，室温孵育30 min；PBS冲洗5 min×3次，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知RASGRF1抗原阳性切片作为阳性对照。

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采用双盲法由两位病理科高年资医师独立阅片。RASGRF1蛋白阳性染色定位于细胞质，呈黄色至棕褐色，颗粒状。每张切片随机选取4个400倍不重叠视野，每视野计数至少100个细胞，评价染色强度，并计数阳性细胞比例。染色强度评分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞比例评分：≤5%为0分，>5%～33%计1分，>33%～66%计2分，>66%为3分。根据染色强度评分和阳性细胞比例评分综合评价，二者乘积≥2为RASGRF1蛋白阳性表达。

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1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

1.3 RASGRF1基因甲基化检测 采用MSP法。取手术切除的结肠癌组织及其配对的癌旁正常组织，按Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit说明提取组织DNA，经核酸蛋白分析仪鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可用于后续实验。取组织DNA 2 μg，加入去离子水稀释至50 μL，与3 mol/L氢氧化钠溶液5.5 μL混匀，37 ℃水浴30 min；加入10 mmol/L氢醌30 μL，轻轻震荡混匀；再加入3.6 mol/L亚硫酸氢钠(pH 5.0)520 μL，轻轻震荡混匀；-20 ℃保存备用。所有引物由上海铭博生物科技有限公司设计合成。甲基化特异性引物：上游引物5′-TTGGACGTTTTTTGTAGTTTTATTTC-3′，下游引物5′-CCCGAAAATTTACGTCTTTACG-3′；非甲基化特异性引物：上游引物5′-TGGATGTTTTTGTAGTTTTATTTTGT-3′，下游引物5′-CATCCCAAAAATTTACATCTTTACAC-3′。PCR反应体系共25 μL：2×HotStar Taq PCR Buffer 10 μL，dNTP Mix 2 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，去离子水11 μL；反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40个循环，最后72 ℃延伸3 min。取PCR扩增产物10 μL，1%琼脂糖凝胶电泳分离甲基化与非甲基化条带，采用凝胶成像仪于紫外线下拍照分析。结果判定：电泳结果中出现甲基化条带伴或不伴非甲基化条带扩增，判定为甲基化；电泳结果中仅出现非甲基化条带扩增，而未出现甲基化条带扩增，判定为非甲基化。

2 结果

2.3 结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达及其基因甲基化阳性与患者临床病理特征的关系 结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关(P均>0.05)；结肠癌组织RASGRF1基因甲基化阳性与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关(P均>0.05)。见表1。

RASGRF1基因是一种Ras蛋白激活因子，定位于人染色体25q15，长6 313 bp。RASGRF1是一种父系印记基因，其编码的RASGRF1蛋白能促进Ras蛋白从Ras-GDP复合体中解离，进而与GTP结合形成Ras-GTP，从而激活特定的Ras信号通路。研究证实，RASGRF1能够激活的Ras蛋白有K-Ras、H-Ras、N-Ras[12,13]。RASGRF1蛋白还可经DHPH2介导直接与微管相连[11]，继而参与细胞的诸多生物学过程。由于RASGRF1蛋白在神经系统中表达较高，目前关于RASGRF1蛋白的研究主要集中在中枢或外周神经系统疾病[14]。近年研究发现，RASGRF1在多种恶性肿瘤的发生、发展中亦具有重要作用[15,16]。Zhu等[15]研究发现，RASGRF1蛋白可参与调控黑色素瘤细胞中基质金属蛋白酶生成，从而影响肿瘤的侵袭和转移；Sacco等[16]研究发现，无论是动物实验还是细胞实验，RASGRF1相关的衍生肽均可通过抑制Ras蛋白，达到抑制肿瘤细胞增殖和迁移。本研究结果发现，结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达率明显低于癌旁正常组织；结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关，与患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关。结果表明，RASGRF1蛋白在结肠癌组织中低表达，其低表达与肿瘤侵袭和转移有关。

2.1 结肠癌组织与癌旁正常组织RASGRF1蛋白表达与基因甲基化比较 结肠癌组织与癌旁正常组织RASGRF1蛋白阳性表达率分别为37.04%(30/81)、91.36%(74/81)，RASGRF1基因甲基化阳性率分别为70.37%(57/81)、18.52%(15/81)。结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达率明显低于癌旁正常组织(χ2=51.995，P<0.01)，RASGRF1基因甲基化阳性率明显高于癌旁正常组织(χ2=44.100，P<0.01)。

表1 结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达及其基因甲基化阳性与患者临床病理特征的关系

3 讨论

近年来，尽管我国临床诊疗水平有了明显提高，但受居民饮食结构、生活习惯、环境变化等因素影响，结肠癌的发病率和病死率并未呈现出全球范围内的下降趋势，反而呈上升趋势[10]。中国癌症统计数据显示，2015年我国结肠癌新发病例37.6万、死亡病例19.1万，其发病率和病死率均居所有恶性肿瘤的第5位[11]。目前对结肠癌发病的具体分子机制仍不十分清楚。因此，探索与结肠癌发生、发展相关的分子机制具有重要意义。

2.2 结肠癌组织RASGRF1蛋白表达与RASGRF1基因甲基化的关系 Spearman等级相关分析显示，结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达与RASGRF1基因甲基化阳性呈负相关关系(ρ=-0.486，P<0.05)。

表观遗传学在基因表达的相关调控机制中具有重要作用。其中，DNA甲基化是表观遗传学修饰的主要方式之一。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶作用下，S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移至胞嘧啶第5位碳原子上，从而形成5-甲基胞嘧啶[17]。编码蛋白质基因的高甲基化状态能直接阻碍基因转录，一般认为DNA非甲基化与基因活化相关，而DNA甲基化则与基因沉默相关，异常的DNA甲基化可导致基因表达异常。不同于基因突变等不可逆的经典遗传学现象，DNA甲基化是一种可逆的动态过程，去甲基化基因可恢复其活性。因此，将异常甲基化的抑癌基因或促癌基因去甲基化有可能抑制肿瘤的发生、发展[18]。有研究发现，RASGRF1基因异常甲基化不仅与神经系统疾病有关，如脑外伤昏迷、癫痫发作等[19，20]，还可参与恶性肿瘤的发生、发展。如Klose等[8]研究发现，RASGRF1基因甲基化异常升高可增加人群罹患胃癌的风险。本研究结果显示，结肠癌组织RASGRF1基因甲基化阳性率明显高于癌旁正常组织；结肠癌组织RASGRF1基因甲基化阳性与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关，与患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关。表明RASGRF1基因甲基化阳性在结肠癌组织中高表达，其高表达与肿瘤侵袭和转移有关。

Konstantinopoulos等[32]通过研究证实，SAHA联合聚PARP抑制剂对卵巢癌细胞的协同作用可能与DNA的同源重组相关。同源重组DNA修复途径中，成员发生频繁的遗传学和表观遗传学改变是浆液性上皮性卵巢癌的特征是，多数存在不同程度的同源重组修复缺陷。PARP抑制剂是针对同源重组缺陷肿瘤的靶向治疗药物，而对具有完整同源重组途径的上皮性卵巢癌治疗作用差。实验观察发现，经SAHA处理后的巢癌细胞中同源重组途径的相关基因RAD51和BRCA1表达下调，并且在体内、体外实验中都能够增加PARP抑制剂对于卵巢癌细胞的毒性作用，证实SAHA的抗肿瘤机制与DNA的同源重组关系密切[32]。

为进一步确定RASGRF1基因甲基化状态与其编码蛋白表达的关系，本研究分析了结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达与RASGRF1基因甲基化阳性的关系。结果发现，结肠癌组织RASGRF1蛋白阳性表达与RASGRF1基因甲基化阳性呈负相关关系。说明结肠癌组织RASGRF1基因甲基化异常升高是RASGRF1蛋白表达下降的重要原因。进一步推断RASGRF1基因去甲基化可能是未来结肠癌治疗的研究方向之一。

综上所述，结肠癌组织RASGRF1蛋白低表达、RASGRF1基因甲基化异常升高，二者呈负相关关系，且均与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关。