茵陈蒿汤对NAFLD伴IR大鼠的肝保护作用及其机制

周伟青，王修银，刘道利，王小英，江桂英

(广州市中医医院，广州510130)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种无过量饮酒史，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性和脂质蓄积为特征的临床病理综合征，虽然通常被认为是一种良性病变，但可在较短期内发展为不可逆性肝损害，其肝纤维化发生率高达25%，且1.5%～8.0%患者可进展为肝硬化[1]。NAFLD的病因和发病机制仍不十分明确，比较公认的发病机制是“二次打击”学说。肝细胞内脂质沉积形成单纯性脂肪肝，造成“初次打击”，在此基础上氧化应激和脂质过氧化损伤，导致肝细胞线粒体和肝细胞本身的持续损伤和炎症形成，即为“二次打击”，从而促进了肝纤维化或肝硬化的发生、发展。在“二次打击”过程中，胰岛素抵抗(IR)贯穿始终[2～4]。茵陈蒿汤是由茵陈蒿、栀子和大黄组成的复方制剂。有研究证实，茵陈蒿汤能够改善脂代谢紊乱，减轻脂质过氧化损伤，具有调脂保肝作用[5]。但其对合并IR的NAFLD是否有效尚不清楚。2018年2月～2019年3月，本研究观察了茵陈蒿汤对NAFLD伴IR大鼠的肝保护作用，并初步探讨其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级SD大鼠120只，6～8周龄，雌雄各半，体质量150～180 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(粤)2008-0002。所有大鼠分笼饲养，4只一笼。饲养环境温度22～26 ℃，湿度40%～70%，光照12 h明暗交替。茵陈蒿汤方药组成：茵陈蒿18 g、栀子12 g、大黄6 g，由广东一方制药厂生产的茵陈蒿、栀子、大黄单味药浓缩颗粒剂组配，其颗粒∶生药分别为1∶17、1∶14、1∶3。r-911型全自动放免计数仪，中国科技大学实业总公司；AU5800型全自动生化分析仪，美国贝克曼库尔特公司；TGL-16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；转化生长因子β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、爱帕琳肽(Apelin)、内脂素(Visfatin)以及网膜素(Omentin) ELISA试剂盒，武汉贝茵莱生物科技有限公司。

1.2 动物分组处理 所有SD大鼠适应性饲养1周，按抽签法随机分为对照组、模型组、辛伐他汀组和茵陈蒿汤低、中、高剂量组，每组20只。模型组、辛伐他汀组和茵陈蒿汤低、中、高剂量组参照文献[6，7]方法建立NAFLD伴IR模型，即普通饲料+10%果糖水喂养6周；第7周开始，模型组给予蒸馏水10 mL/kg灌胃，辛伐他汀组给予辛伐他汀200 mg/kg灌胃，茵陈蒿汤低、中、高剂量组分别给予茵陈蒿汤20、30、40 g/kg灌胃，连续4周，期间继续普通饲料+10%果糖水喂养。对照组普通饲料+蒸馏水喂养。

1.3 血生化指标检测 末次灌胃结束，眶后静脉丛取血，3 500 r/min离心5 min，取上层血清，采用全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)；葡萄糖灌胃2 h，眶后静脉丛再次取血，检测糖负荷2 h血糖(2 h PG)。各组处死前15 min，眶后静脉丛取血，3 500 r/min离心5 min，取上层血清，采用全自动生化分析仪检测肝损伤指标[血清谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、ALT、AST活性]、脂肪肝病变指标[血清胆碱酯酶(ChE)活性]以及脂代谢指标[血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、游离脂肪酸(FFA)]；采用ELISA法检测肝脏纤维化指标(TGF-β1、TNF-α)、脂肪因子指标(Apelin、Visfatin、Omentin)；采用放射免疫法检测空腹胰岛素(Fins)，计算胰岛素敏感指数(ISI)。ISI=ln [1/(Fins×FPG)]。

1.4 肝组织病理学改变和纤维化程度评估 各组禁食12 h，20%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉后称体质量，脱臼处死，快速分离肝组织，肉眼观察肝组织形态学改变，滤纸吸干后称肝脏质量，计算肝脏系数。肝脏系数=肝脏质量/体质量×100%。取各组相同部位肝组织，中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。HE染色，显微镜下评估肝组织病理学评分；Masson染色，显微镜下评估肝纤维化程度评分。肝组织病理学评分：正常肝脏记0分，胶原增多但无间隔产生记1分，有不完全间隔形成记2分，有完全间隔形成但间隔较细记3分，有较厚的完全间隔形成记4分。肝纤维化程度评分：肝组织内除中心静脉及汇管区周围外不见纤维组织记1分，出现少量散在纤维分布记2分，出现大量纤维组织并呈网格状分布记4分，介于二者之间记3分。

2 结果

2.1 各组血清肝损伤、脂肪肝病变、糖脂代谢指标比较 见表1、2。

表1 各组血清GST、ALT、AST、ChE活性比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与辛伐他汀组比较，△P<0.05；与茵陈蒿汤低剂量组比较，▲P<0.05；与茵陈蒿汤中剂量组比较，▽P<0.05。

表2 各组血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与辛伐他汀组比较，△P<0.05；与茵陈蒿汤低剂量组比较，▲P<0.05；与茵陈蒿汤中剂量组比较，▽P<0.05。

2.2 各组肝纤维化指标和脂肪因子水平比较 见表3。

表3 各组血清TGF-β1、TNF-α、Apelin、Visfatin、Omentin水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与辛伐他汀组比较，△P<0.05；与茵陈蒿汤低剂量组比较，▲P<0.05；与茵陈蒿汤中剂量组比较，▽P<0.05。

2.3 各组血清FPG、2 h PG、Fins水平和ISI比较 见表4。

表4 各组血清FPG、2 h PG、Fins水平和ISI比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与辛伐他汀组比较，△P<0.05；与茵陈蒿汤低剂量组比较，▲P<0.05；与茵陈蒿汤中剂量组比较，▽P<0.05。

2.4 各组肝组织病理学变化 对照组肝细胞大小均匀，形态及分布正常，肝索结构呈放射状排列。模型组肝细胞排列紊乱并肿胀，肝索结构紊乱，基本无放射状排列，纤维结缔组织增生明显，且肝细胞内可见脂滴空泡，细胞核偏移明显，汇管区有少量炎性细胞浸润。与模型组比较，辛伐他汀组肝纤维化程度明显减轻，汇管区仅见少量纤维结缔组织增生和炎性细胞浸润，假小叶形成不明显，肝细胞脂肪变性程度较轻。茵陈蒿汤低、中、高剂量组上述病理变化均有不同程度改善，且有随着茵陈蒿汤剂量增加，上述病理变化改善越来越明显。各组肝脏指数及肝组织病理学评分、肝纤维化程度评分比较见表5。

表5 各组肝脏指数及肝组织病理学评分、肝纤维化程度评分比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与辛伐他汀组比较，△P<0.05；与茵陈蒿汤低剂量组比较，▲P<0.05；与茵陈蒿汤中剂量组比较，▽P<0.05。

3 讨论

NAFLD是指除乙醇和其他明确的肝损害因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征。虽然脂肪肝被认为是一种良性病变，但它是许多慢性肝脏疾病的早期阶段，不经治疗的脂肪肝会逐渐发展为肝纤维化，并可引起肝细胞癌变[8～10]。在本研究中，模型组经过长期普通饲料+高糖饮水建模后，病理结果显示肝细胞体积增大,胞质内可见大小不等的脂肪空泡，细胞核居中或偏位，肝窦受压变窄，并出现纤维化病变，提示成功建立了NAFLD模型。血清GST、AST、ALT及ChE活性是反映肝损伤的重要指标，其中AST、ALT能反映肝细胞膜的完整性。与对照组相比，模型组血清GST、AST、ALT、ChE活性明显升高，提示肝功能明显受损，而辛伐他汀组和茵陈蒿汤各剂量组血清上述指标均出现不同程度下降，证实茵陈蒿汤具有肝保护作用。

肝脏是维持糖代谢稳态与调节脂质代谢的重要器官。在“二次打击”学说中，IR及脂代谢失衡被认为是关键致病因素。IR可导致肝糖原分解增加，外周组织糖利用减少，血糖升高，糖毒性和脂毒性均可加重肝损伤及IR，从而形成恶性循环[11，12]。IR是由于机体葡萄糖调节功能下降，导致机体通过代偿分泌更多胰岛素，该现象又可引起机体TC水解及血清FFA水平升高，最终导致血糖升高[13，14]。同时，IR使胰岛素无法高效地抑制脂肪酶活性，这种酶活性增高会导致机体大量脂肪被分解，并经肝门静脉进入肝内，形成脂肪肝，而在氧化应激相关的脂质过氧化及炎性因子作用下，会导致三酰甘油含量增加，进一步导致肝功能损伤[15]。Lagathu等[16]研究发现，过多的FFA可通过增加胰岛素的信号转导抑制因子3，加重IR。本研究结果显示，与对照组相比，模型组FPG、Fins水平明显升高，ISI明显降低；同时，模型组血清TC、TG、LDL-C、FFA水平明显上升，而血清HDL-C水平明显下降。提示模型组出现了糖脂代谢紊乱及IR。而茵陈蒿汤能够降低血糖，明显提高ISI，改善IR并调节糖脂代谢紊乱，且这种作用具有一定量效关系。这可能是茵陈蒿汤保护NAFLD伴IR大鼠肝功能损伤的重要途径。

Omentin是一种由网膜脂肪组织分泌的蛋白质，可促进脂肪细胞胰岛素介导的葡萄糖摄取，胰岛素受体后信号通路中的蛋白激酶B磷酸化，从而提高脂肪细胞胰岛素的敏感性[17]。脂肪因子Visfatin和Apelin对维持体内糖代谢具有重要作用，其水平升高可诱发IR，使FPG水平升高[18，19]。本研究结果显示，茵陈蒿汤与辛伐他汀均可明显降低NAFLD伴IR大鼠脂肪因子Visfatin、Apelin水平，提高Omentin水平。这表明茵陈蒿汤可能是通过改善脂肪因子水平而改善NAFLD伴IR大鼠的IR。

此外，本研究还观察了各组血清TGF-β1、TNF-α水平。TGF-β1是公认的致纤维化因子，而TNF-α水平则表征组织炎性反应程度。TNF-α具有直接的细胞毒性作用，能够产生大量氧自由基(ROS)，导致线粒体功能受损，线粒体内ROS增多能够使肝细胞对TNF-α损伤的敏感性升高，最终引发肝细胞凋亡[20]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组血清TGF-β1、TNF-α水平均明显上升，HE染色和Masson染色结果亦显示，其纤维化程度和炎性浸润程度亦随之增加，而茵陈蒿汤各剂量组和辛伐他汀组肝纤维化程度和炎性细胞浸润程度均有不同程度降低，且随着茵陈蒿汤剂量增加，其效果越来越明显。提示茵陈蒿汤可通过降低血清TGF-β1及TNF-α水平，减轻肝组织纤维化程度和炎性细胞浸润程度。这一结果与茵陈蒿汤对酒精性脂肪肝的保护作用类似[21]。

综上所述，茵陈蒿汤能够剂量依赖性地改善NAFLD伴IR大鼠糖脂代谢，进而减轻肝脏脂肪病变，缓解肝纤维化程度；其机制可能与调节脂肪因子水平、降低IR、改善糖脂代谢紊乱，从而逆转肝细胞损伤有关。