秸秆生物酶法制备可发酵葡萄糖和木糖的分析研究

慈元钊，付玲弟，周凯旋

（山东尤特尔生物科技有限公司，山东济宁 273500）

我国是农业大国，农业秸秆每年的产量约为8亿吨，大量的农业秸秆基本都没有得到有效的利用，焚烧、随意丢弃是主要的处理方式，带来了严重的环境问题。[1-3]

秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素、木素。纤维素是由数以万计葡萄糖分子聚合而成，半纤维素是由戊糖、己糖和糖酸所组成的不均一聚糖，为异质多糖。[4]纤维素、半纤维素均可通过降解产生单糖分子，产生的单糖可进行生物发酵生产乙醇、L-乳酸等。

大部分的实验研究都对秸秆粉末进行了化学或物理方法预处理。化学方法主要是由稀酸、稀碱、氨水等浸泡。利用稀酸预处理容易造成设备的腐蚀，水解液中产生糠醛、呋喃等物质；碱法处理的预水解液中有大量的木素等物质溶出，后续预水解液处理麻烦。物理方法主要通过对秸秆粉末进行微波、蒸汽爆破等，需要消耗大量的能量，与我国节能减排的大方向不一致。还有一些进行物理化学相结合的方式，虽然木质纤维素的水解率有了大幅度的提升，但实际运用起来困难重重并不现实。

王安东等研究了秸秆双酶糖化，但秸秆糖化率较低，也不适合推广。[5]本研究使用尤特尔生产的纤维素酶、木聚糖酶进行处理秸秆粉末，分析不同酶用量以及反应时间下的水解率，为利用秸秆进行生产L-乳酸做好理论基础实验。

1 实验

1.1 实验材料

玉米秸秆购自山东邹城农村，粉碎至1mm左右，置于干燥处备用；纤维素酶、木聚糖酶为山东尤特尔生物科技有限公司生产。

1.2 实验仪器

SP-56型紫外可见分光光度计，DIOONEX-5000离子色谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 酶活测定

纤维素酶测定参照中华人民共和国轻工行业标准QB2583-2003，木聚糖酶测定参照QB/T4483-2013。

1.3.2 酶活pH、温度曲线测定

测定纤维素酶、木聚糖酶酶活的pH、温度曲线，选择最优的处理条件。

1.3.3 酶解反应条件

按1:10的料液比添加最适酶活的pH缓冲液，然后分别加入相应用量的纤维素酶、木聚糖酶混匀，放入已升温至最佳酶活条件下的电热恒温水浴振荡锅中分别反应0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h后取出，振荡速度为150r/min。放入沸水浴中煮沸10 min，冷却，离心。离心得到的残渣再加去离子水洗涤3遍，每遍加水25ml，每次洗涤后离心取上清液，将所有的上清液混合一起测量体积，并测定还原糖浓度，比较不同酶用量以及处理时间下对秸秆的降解效果，以酶解时间为0h的为对照组。

1.3.4 实验分析方法

秸秆组成成分分析。测定处理前的秸秆中水分、纤维素、半纤维素、木质素的组分，分析方法参照《制浆造纸分析与检测》中的测试方法[6]。

还原糖测定。酶降解秸秆产生的单糖采用离子色谱进行分析。

2 结果分析与讨论

2.1 酶活测定

经测定计算，本次实验所用的纤维素酶酶活（CMC）在酸性条件下为3500IU/mL；木聚糖酶酶活在中性条件下为98120IU/mL。

2.2 酶活变化曲线的绘制

测定了纤维素酶、木聚糖酶在pH4.0-9.0，温度30-80℃下的酶活。酶活保留率曲线如图1。

从酶活保留率曲线来看，纤维素酶在pH5.5，温度60℃条件下有最大的酶活，pH在5.0-6.0，温度在50-80℃范围内，酶活保留率均在60%以上。木聚糖酶在pH6.5，温度50℃条件下有最大的酶活，pH在5.5-7.0，温度在40-60℃范围内，酶活均保留在80%以上。说明尤特尔纤维素酶、木聚糖酶的适用范围较为广泛。

2.3 秸秆组分分析结果

秸秆组成成分为纤维素37.43%；半纤维素23.18%；木质素21.03%；水分10.2% 。

2.4 秸秆酶解的单因素实验

2.4.1 纤维素酶酶用量对秸秆水解的影响

称取3g（绝干）秸秆粉，以固液比1:10的比例添加pH5.5缓冲液，根据纤维素酶的最适反应条件置于60℃恒温振荡水浴锅中预热十分钟，振荡速度为150r/min。然后以50IU/g（绝干）、100IU/g、150IU/g、200IU/g、250IU/g、300IU/g、400IU/g、500IU/g 加 入纤维素酶稀释液。在此条件下，反应48h取出，测定葡萄糖含量，计算水解率。实验结果如图2。

秸秆的水解率随纤维素酶用量的增加逐渐增加，但用量超过300IU/g时，水解率提升并不显著，从使用成本考虑，酶用量选择300IU/g。由于纤维素酶的作用位点是固定的，随着用量的增加，发生反应的位点增加，但是酶用量大于作用位点时，水解率便不再大幅度提高。

2.4.2 纤维素酶处理时间对秸秆水解的影响

实验方法参照2.3.1。纤维素酶添加量为300IU/g。在此条件下，每隔12小时取出一个样品沸水浴灭活10min。测定水解率，结果如图3。

随着处理时间的延长，水解率逐渐提升，反应48h以后，水解率提升幅度越来越小。为了节约成本可将水解时间调整为48h。纤维素酶的处理时间越长，秸秆中的纤维素含量越低，水解率增加幅度也逐渐降低。

2.4.3 木聚糖酶酶用量对秸秆水解率的影响

实验方法参照2.3.1，缓冲液使用pH6.5的缓冲液，反应温度50℃，酶用量分别为100IU/g（绝干）、200IU/g、300IU/g、400IU/g、500IU/g、600IU/g、700IU/g、800IU/g。反应时间48h，反应完毕测定水解率。结果如图2所示。

木聚糖酶处理后的秸秆水解率相对纤维素酶处理的较低，木聚糖酶用量在500IU/g以上时，水解率提升速率较低，因此用量选择500IU/g。木聚糖酶主要降解秸秆中的半纤维素组分，因为秸秆中半纤维素与纤维素、木质素相互交缠，半纤维素含量又相对较低，因此其水解率明显低于纤维素的水解率。

2.4.4 木聚糖酶酶处理时间对秸秆水解的影响

实验方法与条件参照2.3.3，酶用量选择500IU/g，每隔12h取出一个样品沸水浴灭活10min。测定水解率，实验结果如图3。

随着处理时间的延长，半纤维素的水解率逐渐增高，48h以后水解率提升幅度较低，因此最佳处理时间选择48h。

图2 不同酶用量下的水解率

图3 不同处理时间下的水解率

2.5 混合酶处理秸秆

根据各单因素实验，确定纤维素酶、木聚糖酶的用量分别为300IU/g、500IU/g。综合两种酶在不同pH以及温度下的酶活保持率，最终选择反应条件pH5.5，温度50℃。根据以上实验每隔12h取出一个样品测定水解率，结果如图4。

图4 混合酶不同处理时间下的水解率

纤维素酶与木聚糖酶混合使用以后水解率比单独使用两种酶的综合效果要好，水解率在72h达到最高，但到84h时水解率有所降低，是由于水解液中细菌的生长，使得水解率呈下降趋势。实际生产过程中，可在酶解之前对秸秆进行灭菌处理，同时高温也会导致秸秆的纤维疏松，提高水解率。

3 结论

实验过程先测定纤维素酶、木聚糖酶的酶活变化曲线，为秸秆酶解条件的选择节省了大量的时间和精力。纤维素酶直接处理秸秆粉末，水解率最高可达27.5%。木聚糖酶单独使用时，其最高水解率可达15%。而在两种酶的共同作用下，最高水解率为43.1%。

生物酶法直接处理秸秆粉末，目前虽然水解率没有使用化学方法预处理后再使用酶处理的高，但酶法条件温和，较容易操作，对环境影响较小。是当前比较理想的一种行之有效地秸秆处理方法。