粉丝加工废水发酵生产农用γ-聚谷氨酸工艺优化

2019-07-18 08:42贾玉萍赵建文李维焕盖宇鹏程显好
生物化工 2019年3期
关键词:谷氨酸钠谷氨酸葡萄糖

贾玉萍,赵建文,李维焕,盖宇鹏,程显好*

(1.鲁东大学 农学院,山东烟台 264000;2.烟台东方科技蛋白有限公司,山东招远 265400)

γ-聚谷氨酸是由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成的一种多肽分子,具有水溶性、生物可降解性、生物相容性、金属螯合性、可食无毒等优点[1-2],在农业[3-4]、环保[5]、医药[6]、食品[7]和化妆品[8]领域应用前景广阔。目前,γ-聚谷氨酸主要通过化学合成、酶转化、提取、微生物发酵生产。早在1937年,Ivanovie等[9-10]从炭疽芽孢杆菌的荚膜中发现。随后Bovarniek等[11]研究发现,有些芽孢杆菌属细菌能在发酵培养基中分泌γ-聚谷氨酸。之后,微生物法发酵生产γ-聚谷氨酸的研究成为热点。和前三种方法相比,微生物发酵法生产工艺简单、易于调控、适用于大规模生产。微生物深层发酵所需原料价格较高,是目前市场价格居高不下的主要原因,因此,使用低成本的原料是降低γ-聚谷氨酸成本的关键。许多研究者都在寻找更廉价的组分,废料成为重要的方向之一[12-14]。Dan Zhang等[15]报道了利用未处理的甘蔗糖蜜和谷氨酸钠废液发酵生产γ-聚谷氨酸,环保、经济,通过分批补料发酵72 h使得γ-聚谷氨酸产量达到52.1 g/L。Chao Zhang等[16]研究了以鱼粉废水为廉价氮源,利用枯草芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸,产量达到25.07 g/L。虽然皆利用废液通过微生物发酵生产γ-聚谷氨酸,降低了生产成本,但是发酵周期长。

粉丝行业作为山东省招远市的支柱产业之一,占据了我国粉丝加工业的半壁江山。废水问题是粉丝行业存在的重要共性问题,每吨粉丝原料加工都伴随着12~15 t高浓度有机废水的产生,招远市每年产生的粉丝废水达600万吨以上。这些废水中含有丰富的蛋白质、膳食纤维、低聚糖等多种营养物质,COD、BOD、SS等指标极高,但此类污水治理难度大、投入成本高,同时造成了资源的严重浪费。所以如何将此类废水资源化利用,符合既要“金山银山”又要“绿水青山”的绿色生态生产理念。

本研究以粉丝加工废水为原料生产γ-聚谷氨酸,不仅可以解决粉丝加工行业废水处理问题,抵消废水处理成本,还可以解决γ-聚谷氨酸生产成本过高、使用局限的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

葡萄糖、牛肉膏、氯化钠、琼脂、谷氨酸钠、磷酸氢二钾,均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器

CP21电子天平、SBA-40E型生物传感分析仪、FE20 pH计、LCT-IDS-A净化工作台、HZQ-Q全温振荡器、LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器、鼓风干燥箱、HPS-400生化培养箱、凯氏定氮仪等。

1.1.3 试验菌种及废水

试验菌种:已提交至中国微生物菌种保藏中心保藏的菌株 Bacillus subtilis LD-9308。

粉丝废水:本研究中所用到的粉丝废水来自于烟台东方蛋白科技有限公司。

1.1.4 培养基

(1)斜面培养基:蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、NaCl 0.5%、琼脂 2%,pH7.2。

(2)液体培养基(g/L):蛋白胨1%、牛肉0.3%、NaCl 0.5%,pH7.2。

(3)发酵培养基(g/L):葡萄糖2%、谷氨酸钠2%、磷酸氢二钾0.15%、粉丝废水,pH7.5。

1.2 培养条件

(1)斜面培养:挑取保藏菌种接种至斜面培养基中,37 ℃培养12~24 h,作为活化菌种备用。

(2)种子培养:挑取一环活化菌种接至盛有100 mL种子液的500 mL摇瓶中,置于摇床中37 ℃,200 r/min培养12 h,作为种子液备用。

(3)发酵培养:吸取上述种子液1 mL至含有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中,放置于摇床培养,37 ℃,200 r/min培养 26 h,得到 γ- 聚谷氨酸发酵液。

(4)测定方法:高效液相色谱法(HPLC),按照企业标准 Q/FSK 001—2012。

1.3 试验方案

1.3.1 粉丝加工废水组成及特征参数测定

(1)pH:pH计测定。

(2)固体含量:取一定量粉丝加工废水在105~110 ℃烘干后,称重。

(3)粗蛋白含量:凯氏定氮法测定,GB/T5009.5-2016。

(4)还原糖:高锰酸钾滴定法,GB/T5009.7-2016。

(5)化学需氧量(COD):重铬酸钾法,GB/T11914-1989。

1.3.2 单因素条件优化发酵培养基

(1)葡萄糖含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。在基础发酵培养基的基础上,分别以0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%和5.00%的葡萄糖含量梯度进行实验,来考察葡萄糖含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。

(2)谷氨酸钠含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。在基础发酵培养基的基础上,分别设置2%、3%、4%、5%和6%含量梯度的单因素条件,测定γ-聚谷氨酸产量。

(3)磷酸氢二钾含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。在基础发酵培养基的基础上,分别设置0%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%和0.50%的磷酸氢二钾含量梯度的单因素条件,测定不同含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。

1.3.3 单因素条件优化发酵条件

(1)发酵时间。考察不同发酵时间20、22、24、25、26、28 h 和 30 h 下 γ- 聚谷氨酸的产量,以确定最佳发酵时间。

(2)初始pH。调节培养基的初始pH值分别为6.00、6.50、7.00、7.25、7.50、7.75、8.00,发 酵 培养一定时间,测定γ-聚谷氨酸的产量。

1.3.4 正交试验发酵工艺优化

利用SPSS软件进行正交试验设计,在单因素试验结果的基础上对培养基配方中葡萄糖含量、谷氨酸钠含量、磷酸氢二钾含量行正交试验,每组实验3个平行,测定γ-聚谷氨酸含量,以选出最优组合。因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 粉丝加工废水组成及特征参数结果

测定10个批次的废水成分,其组成及特征结果见表2。由表2可知,受前段生产工艺的影响,废水的固形物含量会有波动,但其pH值、碳氮比比较稳定。

表2 粉丝加工废水组成及特征

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 单因素条件优化发酵培养基结果与分析

(1)葡萄糖含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。葡萄糖含量在0.5%~2.0%时,γ-聚谷氨酸产量随葡萄糖含量的增加而增多,在2.0%时产量最高,高达31.76 g/L。之后,γ-聚谷氨酸产量随葡萄糖含量增加而下降,结果如图1所示。葡萄糖是微生物生长所需能量的重要来源,葡萄糖含量对目标产物的积累有很重要的影响。

图1 葡萄糖含量与γ-PGA产量的关系

(2)谷氨酸钠含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。如图2所示,谷氨酸钠含量在2%~5%时,γ-聚谷氨酸的产量随着谷氨酸钠含量的增加而增加,在5%最高可达41.89 g/L,之后开始下降。由于谷氨酸钠是合成γ-聚谷氨酸的前体物,在添加谷氨酸钠的情况下,γ-聚谷氨酸的产量能够得到较大的提升,但过高的前体物存在反而会抑制γ-聚谷氨酸的生成。

(3)磷酸氢二钾含量对γ-聚谷氨酸产量的影响。磷酸氢二钾对γ-聚谷氨酸的产量影响较大,其含量在0.25%时γ-PGA产量最高,超过0.25%以后,产量呈下降趋势,如图3所示。

图2 谷氨酸钠含量与γ-PGA产量的关系

图3 磷酸氢二钾含量与γ-PGA产量的关系

2.2.2 单因素试验优化发酵条件

(1)发酵时间。如图4所示,发酵时间为20~26 h时,γ-聚谷氨酸产量随时间的增长而增加,在26 h时最高,达49.16 g/L,随后产量开始下降,因此确定26 h为最佳发酵时间。发酵时间对于目标产物的积累具有很重要的影响。时间过长会导致产物降解,时间过短会使得产物不足。在发酵过程中,不仅要满足发酵生产中菌种对于营养条件的要求,还需要维持菌种适宜的发酵培养条件的稳定。

图4 发酵时间与γ-PGA产量的关系

(2)初始pH。如图5所示,pH值在6.0~7.5范围内,γ-聚谷氨酸产量随pH的增长而增加,在7.5产量最高达50.68 g/L,之后产量开始下降。

发酵过程中培养基的pH值对菌体的生长和产物的合成有很大的影响。pH是反映微生物发酵过程当中培养条件是否稳定的重要指标,是一项重要的发酵参数,酸碱度的变化很大程度上影响着菌体的生长状态。pH值的变化在调节酶活、维持微生物细胞的运输机制等方面都起着重要作用,pH值的变化也会促进或抑制一些营养物质的吸收,甚至能够影响菌体的生长和发酵产物的合成,因此确定发酵过程的最适pH值是保证或提高产量的重要环节[17]。

图5 pH与γ-PGA产量的关系

2.3 正交试验对发酵培养基成分含量优化结果与分析

正交试验结果见表3。由表3可知,B因素是影响指标值的最主要因素,即谷氨酸钠含量对γ-聚谷氨酸产量的影响最大。

表3 正交试验设计及结果分析

各因素对γ-聚谷氨酸产量影响主次顺序为B>A>C,最佳组合为A2B3C3,在初始pH为7.5,发酵时间26 h的条件下,得到γ-聚谷氨酸产量为53.7 g/L。

3 结论

为了实现资源合理利用、降低聚谷氨酸生产成本,利用粉丝废水发酵生产聚谷氨酸,并优化了发酵培养基配方及条件:葡萄糖2%,谷氨酸钠5%,磷酸氢二钾0.3%,初始pH值7.5,121 ℃灭菌20 min,500 mL 三角瓶,装液量 100 mL,摇床转速200 r/min,37 ℃振荡培养 26 h。

聚谷氨酸作为一种新型、高效的农肥和植物增产剂,能亲水保水、平衡土壤酸碱度、结合沉淀重金属、增强植物抗病抗逆能力。目前限制其在农业大规模推广应用的主要因素是价格高。本研究以粉丝加工废水为主要原料生产农用聚谷氨酸,降低产品生产成本的同时,也消除了难以处理的废水,节约了企业污水处理费用。通过原料创新、工艺创新,使产品生产成本大大降低,经济效益、环境效益显著。

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