白百合叶提取物抑制UVB诱导的皮肤色素沉着研究

刘晓英，刘光荣，唐健，车飙

（无限极(中国)有限公司，广东广州 510663）

皮肤色素沉着源自于位于基底层的黑色素细胞，之后通过黑色素细胞树突转移周围的角质形成细胞中[1]。黑色素形成过程复杂，受多种内外因素如紫外辐射或药物等影响。黑素体是黑色素细胞特有的细胞器，包含黑色素合成4个阶段需要的多种酶。黑色素细胞蛋白PMEL（黑素体前体蛋白）是黑素体从阶段1到阶段2的关键蛋白，与内部形成结构基质纤维有关[2]。酪氨酸酶作为黑色素合成的限速酶也存在于黑色素体阶段2中[3-5]。

当黑色素合成完成，黑素体将从核周区转移到黑色素细胞树突，通过rab27a形成的复合体与肌动蛋白丝结合[4]。在人的表皮中，每个黑色素细胞通过树突与30～40成纤维细胞结合，通过质膜小泡将成熟的黑素体转运到角质形成细胞的细胞质中，以保护DNA免受UV破坏[6-8]。

小眼畸形相关转录因子MITF是黑色素合成的关键转录因子，它的磷酸化形式调控黑色素合成酶的表达[9-10]。SCF/KIT通路激活MITF转录因子，角质形成细胞产生的SCF与其受体KIT结合诱导钙通路，KIT是Ⅲ型酪氨酸激酶跨膜受体[11]。然而，在人皮肤外植体中注射SCF会增加黑色素细胞数量，大小及树突的形成，而截断了SCF及KIT的结合将抑制这些效果[12]。

UV是诱导黑色素生成的最重要外界因素。UV照射增加表皮黑色素主要是UVB的作用[13-15]。晒黑主要是由于黑素细胞的增殖或积聚，通过增加黑色素合成酶增加黑色素的合成，增加树突数量和黑素体往角质形成细胞转移[16]。UV照射黑色素细胞增加POMC（阿黑皮素，αMSH前体）的表达和受体MC1-R（黑素皮质素1受体）的表达，导致αMSH的产生并激活黑色素合成酶及其他信号因子的表达[17]。此外，UV照射后，角质形成细胞也通过旁分泌内皮素(ET-1)和POMC影响黑色素形成[18-19]。

1 材料与方法

1.1 皮肤等效模型

带黑色素皮肤模型，购自法国LabSkin Creations。皮肤模型的构建方法参考Dos Santos等于2015年发表的文章[20]。培养至第7代的成纤维细胞以250 000 cells/cm2接种于胶原糖胺聚糖真皮支架中，增殖并合成细胞外基质，从而形成真皮类似物[21]。在真皮类似物培养基中培养28天后，将角质形成细胞以250 000 cells/cm2接种于真皮等效物中以形成皮肤等效模型[22]。

皮肤等效模型在角质形成培养基中浸泡1周后，上升至气液交界面，培养45天后，角质形成细胞完全分化为成熟表皮。第35天，在培养基中加入0.2%白百合细胞提取物及0.03%珍珠水解壳聚糖蛋白，与无活性成分培养的重组皮肤模型进行对比。培养45天后，部分等效模型使用UVB 100 mJ/cm2照射，照射后24 h，样品冻于-80 ℃或使用4%的福尔马林固定。每个实验条件每种固定方法各3个样品。

1.2 基因表达分析

提取皮肤等效模型的总RNA后，使用NextSeq 500高通量测序，每个样本读取4 000万次。与人类基因组进行比对后，对实验组结果进行差异分析，寻找被下调的通路，重点关注与黑色素生成相关的基因。

1.3 组织学染色

固定包埋后的样品切成5 μm的薄片，HPS（苏木精-根皮红-藏红花）染色以观察皮肤模型的结构。脱蜡至水后使用3种染色剂（苏木精-根皮红-藏红花）染色5 min，切片脱水处理后放入疏水介质中。

为了评价黑色素合成，使用改良的Warthin Starry银染试剂盒检测等效模型的黑色含量（Merck）。脱蜡及再水化后，切片使用6%的硝酸银溶液孵育20 min，清水洗以停止银染。之后使用对苯二酚及明胶混合物孵育20 s。这一步使得黑色素由深棕色变成黑色，皮肤模型由黄色变成橙色。

1.4 免疫荧光

使用 4% 甲醛固定 20 min 用含 3% Triton100 PBS打孔。使用含有4%BSA的PBS封闭30 min以避免非特异结合。一抗孵育过夜，抗体如下:黑色素细胞PMEL（兔抗）、KIT（鼠抗），PBS洗3次。二抗为Alexa-568 鼠抗或兔抗，室温孵育1 h。细胞核用Hoechst染色（Thermo Fisher Scientific）。

1.5 图像采集及分析

免疫染色及组织学染色图像采集使用Axio observer D1荧光显微镜（蔡司）观察。使用HRc AxioCam镜头和ZEN 2软件捕获图像，保存为TIFF格式。使用IMAGEJ软件进行图像处理及分析。对所有数据，使用单因素T测试分析统计学显著性差异，表示为*P＜0.05，**P＜0.01，**P＜0.001。对于黑色素表达分析，黑色像素代表表皮黑色素，与其他像素区分。数据根据基底膜的长度进行归一化，结果用μm2/μm表示。

2 结果与分析

2.1 带色素皮肤模型的构建

对重组皮肤进行组织学染色，未处理组结果显示，成纤维细胞定植于胶原-糖胺聚糖-壳聚糖支架中，并分泌细胞外基质形成真皮类似物。表皮完成了从基底层到角质层的分化。如图1所示，紫外线照射后24 h，表皮中被晒伤的细胞出现细胞核固缩现象。

图1 使用苏木精-根皮红-藏红花对重组皮肤模型染色

2.2 皮肤模型黑色素含量分析

如图2所示，使用改良的Warthin Starry染色法对重组皮肤模型的表皮进行染色，黑色颗粒未黑色素。图像分析显示，UVB照射后，重组皮肤模型黑色素生成明显增加。UVB照射与否，加入白百合细胞提取物后，重组皮肤模型黑色素含量与其对照组相比都明显减少。

图2 表皮黑色素的表达

（a）Warthin Starry 染色，棕色颗粒为黑色素。每个样品取3张图片进行数据分析。（b）表皮长度归一化后，自动定量分析表皮黑色素面积。统计分析:t- 测试，** p ＜ 0.05 *** p ＜ 0.001。

2.3 PMEL表达分析

使用免疫荧光检测表皮基底层黑色素相关蛋白PMEL的表达。PMEL与黑色素从黑色素细胞到角质形成细胞的转移相关。如图3所示，对比空白对照组，UVB照射后PMEL表达显著增加。对比UVB照射组，加入白百合细胞提取物后，PMEL表达显著下降。

表皮长度归一化后，自动定量分析免疫荧光PMEL阳性面积。统计分析:t-测试，** p＜0.05，*** p ＜ 0.001。

2.4 关键基因蛋白表达情况

将转录组数据均一化处理后，进行了不同组别基因表达的比较，发现了与黑色素合成相关通路的差异表达基因——kit基因。KIT与MITF的磷酸化相关。

图3 表皮黑色素细胞蛋白PMEL表达

使用Image J对免疫荧光图像进行分析，结果如图4，UVB照射组与空白对照组没有明显差异。而在UVB照射组及空白组中加入白百合细胞提取物后，都明显减少KIT蛋白的表达。

图4 表皮KIT蛋白表达

总表皮面积归一化后，自动定量分析免疫荧光KIT阳性面积。统计分析:t-测试，*** p＜0.001。

3 结论

皮肤模型培养第10天，将白百合叶细胞提取物加入培养基中。随后使用100 mJ/cm2UVB照射重组皮肤。对于有无照射UVB的皮肤，白百合叶细胞提取物减少皮肤模型黑色素含量。白百合叶细胞提取同时调控黑色素从黑色素细胞到角质形成细胞的转移，通过下调PMEL蛋白的表达。

初步研究表明，白百合叶细胞提取物具有抑制皮肤色素沉着的效果。而笔者尝试寻找其作用机理，进一步研究与色素沉着相关基因的表达。通过转录组测试，笔者发现两个与黑色素生成相关的基因——kit基因。UVB照射后，kit基因表达上调。KIT是角质形成细胞分泌干细胞生长因子SCF的受体，SCF/KIT通路与转录因子小眼相关因子（MITF）的激活相关，而MITF是黑色素合成酶表达调控的主要转录因子。

使用白百合细胞提取物处理UVB照射后的皮肤模型，KIT基因表达及蛋白表达明显下调。与之前研究一致，SCF/KIT通路与UVB诱导的体内体外皮肤色素沉着的机制有密切关系[23]。已有报道证明，其他植物提取物通过影响KIT蛋白的表达下调黑色素细胞黑色素的生成[24]，但本课题是首次利用重组皮肤模型，证明植物提取物通过抑制KIT的表达达到美白效果。