miR-9-5p对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

郭 亮，肖 峻，陶 陶

前列腺癌(prostate cancer,PCA)是最常见的癌症之一，也是全世界尤其是发达国家男性癌症死亡的第二大原因。大多数患者最初对雄激素剥夺疗法(ADT)敏感，然而逐渐对ADT无效，最终演变为去势抗性前列腺癌(CRPC)[1]。CRPC难以治疗，且容易发生骨转移等，一旦发生转移预后极差[2]。因此，深入了解PCA转移的分子机制将有助于提高PCA的治疗。微小RNA (microRNA, miRNA) 是一类进化上保守的非编码小分子RNA，具有在转录水平调控基因表达的功能,通过调控关键基因的表达参与多种细胞活动，包括肿瘤的发生和转移[3]。已有多项报道显示miR-9-5p与肺癌[4]、乳腺癌[5]、口腔鳞状细胞癌[6]、骨肉瘤[7]等肿瘤均存在相关性，在肺癌中具有促癌的作用，而在口腔鳞状细胞癌中具有抑癌作用。该研究通过real-time PCR分析了前列腺上皮细胞和前列腺癌细胞中miR-9-5p的表达水平，并在前列腺癌细胞中过表达miR-9-5p，观察miR-9-5p对前列腺癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料人永生化前列腺上皮细胞RWPE-1、前列腺癌细胞PC3和DU145均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；FBS、RPMI1640培养基、KSF培养基、胰酶、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和牛脑垂体提取物(bovine pituitary extract,BPE)均购自美国Gibco公司；携带has-miR-9-5p的慢病毒(miR-9-5p)和阴性对照慢病毒(miR-NC)购自上海汉恒生物科技有限公司；Polybrene和Puromycin购自美国Sigma公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；MMLV Reverse Transcriptase试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；GenePharma Hairpin-it TM microRNA RT-PCR Quantitation Kit和miR-9-5p mimic购自苏州吉玛基因股份有限公司；Transwell小室(8 μm)和Matrigel基质胶购自美国Corning公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；DualLuciferase Reporter Assay System购自美国Promega公司；二氧化碳培养箱购自日本SANYO公司；Real-time PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；Nanodrop 2000微量分光光度计购自美国Thermo公司；酶标仪购自美国Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 RWPE-1用含EGF、BPE、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的KSF培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养。PC3和DU145使用含10%FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基培养。

1.2.2稳定表达miR-9-5p细胞株的建立 向24孔板每孔接种5×104个PC3细胞，培养过夜。次日弃去培养基，用含10%FBS的RPMI1640培养基稀释病毒并加入终浓度为10 mg/L的Polybrene，每孔加入2 ml稀释病毒液使得感染复数(multiplicity of infection, MOI)为20，于37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养24 h，换成新鲜培养基继续培养72 h，改用含Puromycin的培养基持续培养2周，筛选出稳定表达miR-9-5p的PC3细胞(PC3/miR-9-5p)，同时制备稳定感染阴性对照慢病毒的PC3细胞(PC3/miR-NC)，在荧光显微镜下观察确定细胞表达绿色荧光，通过荧光定量PCR检测细胞中miR-9-5p的表达水平。

1.2.3RNA提取和荧光定量PCR 细胞总RNA提取按照TRIzol说明书进行，用Nanodrop 2000微量分光光度计检测A260和A280，计算纯度和含量；使用MMLV Reverse Transcriptase试剂盒(大连宝生物公司)将总RNA转录成cDNA。再采用GenePharma Hairpin-it TM microRNA RT-PCR Quantitation Kit检测miR-9-5p。PCR反应在ABI StepOne Plus系统上进行，反应条件：95 ℃、10 min为预变性阶段条件；95 ℃、12 s，62 ℃、40 s，共40个循环的扩增阶段条件；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s为溶解曲线阶段条件。以U6作为内参，2-ΔΔCT法计算miR-9-5p的相对表达量。对于CXCR4 mRNA的定量检测同样在ABI StepOne Plus系统上进行，反应条件为50 ℃、2 min，95 ℃、10 min为预变性阶段条件；95 ℃、20 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。扩增使用的引物为CXCR4 (accession number: NM_000201)F：5′-ATGCCCAGACATCTGTGTCC-3′，R：5′-GGGGTCTCTATGCCCAACAA-3′; U6 snRNA(accession number: NR_004394) F:5′-GCTTCGGCAGCACATA-3′，R：5′-ATGGAACGCTTCACGA-3′; GAPDH F：5′-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3′，R：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.4细胞增殖能力检测 细胞增殖能力检测使用CCK-8试剂盒进行分析。将处于对数生长期的各组细胞用胰酶消化后按照2 000个细胞/孔接种96孔板，孵育过夜，每孔加入10 μl CCK-8溶液，于接种细胞后0、24、48、72、96 h通过酶标仪检测A450值，评价细胞增殖能力。每个时间点检测6个复孔，细胞增殖能力与A450值呈正相关性。

1.2.5细胞迁移和侵袭力检测 细胞用胰酶消化后用不含血清的培养基稀释细胞，将细胞浓度调整至3×105个/ml，每孔接种0.1 ml至覆盖或不覆盖基质胶的48孔Transwell膜上，在下方加入0.6 ml含10%FBS的培养基，对于迁移实验则继续培养24 h；对于侵袭实验则继续培养24 h；随后将细胞固定，用0.1%结晶紫染色，在显微镜下计数不同组穿膜的细胞数目。

1.2.6生物信息学分析 通过TargetScan7.1(http://www.targetscan.org/)、PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/)、miRanda (http://www.microrna.org/)三种软件分析miR-9-5p与CXCR43’-UTR的结合位点。

1.2.7双萤光素酶报告基因分析 从通用生物技术有限公司购买包含野生型CXCR43’-UTR及预测与miR-9-5p结合位点突变的CXCR43’-UTR荧光素酶报告基因质粒pGL3-CXCR4和mut-pGL3-CXCR4。将293T细胞接种至24孔板，过夜培养后将荧光素酶报告基因质粒、内参质粒(Renilla luciferase)和miR-9-5p mimic或对照同时转染细胞。48 h后根据DualLuciferase Reporter Assay System的说明书操作裂解细胞，加入发光液后在酶标仪上检测。利用海肾素荧光作为内参照对结果进行均一化处理。

2 结果

2.1 荧光定量PCR检测miR-9-5p在RWPE-1、PC3和DU145细胞中的表达荧光定量PCR检测显示miR-9-5p在RWPE-1细胞中表达水平最高为(116.3±4.99)，DU145次之，为(42.30±2.66)，PC3最低为(23.47±2.43)。PC3细胞中miR-9-5p的表达量显著低于RWPE-1(t=16.72,P=0.000 1)和DU145(t=5.22,P=0.016)，因此选择PC3细胞进行后续试验。见图1。

图1 荧光定量PCR检测miR-9-5p在RWPE-1、PC3和DU145细胞中的表达

A：miR-9-5p在不同细胞中的表达水平；B：PCR扩增的溶解曲线；与PC3比较：*P<0.05，**P<0.01

2.2 荧光定量PCR检测miR-9-5p在PC3细胞中过表达荧光定量PCR检测显示稳定转染miR-9-5p的PC3/miR-9-5p细胞中miR-9-5p的表达量为(165.20±5.78)，而在PC3/miR-NC细胞中表达量为(25.47±5.78)(t=22.42,P<0.000 1)，在PC3细胞中表达量为(25.56±3.01)(t=21.43,P<0.0001)，差异有统计学意义。见图2。

2.3 miR-9-5p抑制PC3细胞增殖CCK-8法检测各组细胞的增殖情况显示，与细胞对照及慢病毒对照组相比，miR-9-5p能显著抑制PC3细胞的增殖。见图3。

2.4 miR-9-5p抑制PC3细胞的迁移和侵袭Transwell实验结果显示PC3、PC3/miR-NC和PC3/miR-9-5p组迁移细胞计数分别是(1 194.05±82.33)、(1 189.33±95.97)、(461.30±49.97)，与PC3和PC3/miR-NC组相比，PC3/miR-9-5p细胞迁移数目显著减少(F=265.31，P<0.0001)。PC3、PC3/miR-NC和PC3/miR-9-5p组侵袭细胞计数分别是(786.30±42.45)、(816.31±17.34)、(197.14±45.02)，与PC3和PC3/miR-NC组相比，PC3/miR-9-5p细胞迁移数目显著减少(F=281.24，P<0.000 1)。见图4。

图2 荧光定量PCR鉴定miR-9-5p在PC3细胞中过表达

A：miR-9-5p在不同细胞中的表达水平；B：PCR扩增的溶解曲线；1：PC3/miR-9-5p细胞；2：PC3/miR-NC细胞；3：PC3细胞；与PC3/miR-9-5p细胞比较：**P<0.01

图3 miR-9-5p能够抑制PC3细胞增殖

2.5 miR-9-5p能够靶向作用于CXCR4 3’-UTR抑制CXCR4的表达通过生物信息学预测显示miR-9-5p能够靶向结合CXCR4的3’-UTR(图5A)；双荧光素酶报告基因分析显示，miR-9-5p能够靶向作用于CXCR4的3’-UTR抑制萤光素酶表达，当对CXCR4的3’-UTR域进行点突变处理后，miR-9-5p的抑制作用消失(图5B、5C)。荧光定量PCR检测的结果显示，在过表达miR-9-5p的PC3/miR-9-5p细胞中，CXCR4的表达水平显著低于PC3细胞(t=8.14,P=0.001 2)和PC3/miR-NC细胞(t=11.38,P=0.000 3)(图5D)。

图4 miR-9-5p抑制PC3细胞的迁移和侵袭

A：细胞迁移(24 h)；B：细胞侵袭(48 h)；1：PC3; 2:PC3/miR-NC；3：PC3/miR-9-5p;C：细胞迁移计数比较；D：细胞侵袭计数比较；a：PC3/miR-9-5p细胞；b：PC3/miR-NC细胞；c：PC3细胞；与PC3/miR-9-5p细胞比较：**P<0.01

图5 miR-9-5p靶向作用于CXCR4 3’-UTR抑制CXCR4的表达

A：生物信息学预测miR-9-5p靶向结合CXCR4的3’-UTR；B：双荧光素酶报告基因分析示意图；C：双荧光素酶报告基因检测结果；D：荧光定量PCR检测CXCR4 mRNA的表达水平；1：PC3细胞；2：PC3/miR-NC细胞；3：PC3/miR-9-5p细胞；与PC3细胞比较：**P<0.01；与PC3/miR-NC细胞比较：##P<0.01

3 讨论

越来越多的证据表明异常表达的miRNA通过干扰miRNA /蛋白质编码基因调控网络引起肿瘤的发生、发展和转移[8]。鉴定异常表达的miRNAs是阐明miRNA引起肿瘤的第一步。一些临床研究已经表明在PCA存在大量异常表达的miRNAs，其中一部分作为癌基因或抑癌基因发挥重要作用[9]。越来越多的研究显示在多种肿瘤中miR-9-5p起着抑癌基因的作用，例如在口腔鳞状细胞癌患者外周血中miR-9-5p的表达水平显著下降[6]；在骨肉瘤中由于miR-9-5p表达水平下降，导致其靶基因POU2F1的表达水平上升，从而促进了肿瘤的进展[7]。此外，在肝脏星状细胞中miR-9-5p能够靶向作用于TGFBR1和TGFBR2抑制肝脏纤维化的进展[10]。在TGF-β诱导的人真皮成纤维细胞纤维化过程中miR-9-5p能够靶向作用于TGFBR2，抑制其表达，从而抑制纤维化的进展[11]。

趋化因子(CXCL)及其受体(CXCR)在多种细胞过程中发挥着重要作用，近期的研究[12]显示其也参与了肿瘤的发生和发展。CXCRs在多种肿瘤类型中均高表达，包括乳腺癌、PCA、胰腺癌、肺癌和卵巢癌等[13]。CXCR4已被证实在癌症的发展中具有重要作用，并可作为各种癌症的预后标志物[14]。一些研究显示CXCR4在PCA中高表达，并与预后差密切相关，且参与PCA细胞的增殖、迁移和侵袭[15]。

本研究比较了正常PCA细胞RWPE-1以及PCA细胞株PC3和DU145，发现RWPE-1中miR-9-5p的表达水平显著高于PC3和DU145。通过慢病毒构建了稳定表达miR-9-5p的PC3细胞株，发现过表达miR-9-5p的PC3细胞(PC3/miR-9-5p)的增殖能力较慢病毒PC3/miR-9-5p和正常PC3显著降低。Transwell细胞迁移和侵袭实验显示过表达miR-9-5p也可以显著降低PC3细胞的迁移和侵袭能力。通过生物信息学软件预测发现miR-9-5p能够靶向作用于CXCR4的3’-UTR，双荧光素酶报告基因的结果证实预测结果是正确的。在过表达miR-9-5p中CXCR4的mRNA水平显著下降了。上述实验结果表明miR-9-5p在PCA中可能通过靶向作用于CXCR4的3’-UTR，下调CXCR4表达，抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭。

总之，本研究结果显示miR-9-5p可能通过下调CXCR4表达抑制PCA的增殖、迁移和侵袭。分析miR-9-5p调控PCA细胞生物学功能对PCA的诊断、治疗及预后评价有重要意义。