食物过敏患儿临床特点及血清IL-10、IL-2R、IL-8水平研究

盛 瑶，吴 成，李传应

食物过敏根据免疫机制的不同，可分为IgE或非IgE型[1]。IgE介导食物过敏主要涉及Ⅰ型变态反应，非IgE介导的食物过敏主要涉及Ⅲ型变态反应和Ⅳ型变态反应(T细胞介导)[2]。目前普遍认为效应性T细胞(effector T cells，Teffs)中辅助性T细胞(helper T cell，TH)亚群TH1/TH2失衡、调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)功能紊乱是食物过敏重要分子机制之一。白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)及其受体(interleukin-2 receptor，IL-2R)在调控Teffs及Tregs的功能中起到重要作用。IL-10主要由Tregs分泌，是一种免疫抑制因子，对食物过敏免疫耐受性至关重要[3-4]，目前上述细胞因子在不同免疫机制介导的食物过敏患儿体内变化特点尚无相关文献报道[5]。该研究考察食物过敏患儿临床特点及上述细胞因子水平，为进一步探究不同免疫途径介导的食物过敏相关消化道疾病的免疫学机制提供有价值的线索。

1 材料与方法

1.1 病例资料选择安徽省儿童医院消化内科2017年12月～2018年6月临床诊断为食物过敏患儿共52例为研究组，所有患儿通过饮食回避、母乳喂养患儿母亲严格回避过敏食物或更换游离氨基酸配方粉后，食物过敏症状减轻或消失，再次进食该食物，食物过敏症状再次出现，即食物回避-激发试验阳性[6]。另排除其他可引起消化道症状的原因，如先天性巨结肠、炎症性肠病、麦克尔憩室等。根据患儿血清食物特异性IgE抗体水平高低，分为非IgE组(36例)及IgE组(16例)。同时选取2017年12月～2018年6月于安徽省儿童医院体检的15例健康儿童作为对照组。研究组与对照组在性别和年龄上差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。该研究已通过安徽医科大学附属省儿童医院伦理委员会审批，并与患儿家长签署知情同意书。

表1 食物过敏患儿与对照组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1血细胞学检测 取研究组患儿及正常对照组儿童外周静脉血2 ml加入肝素抗凝管中，测定全血细胞计数(complete blood count，CBC)与差分计数，以评估白细胞数(×109/L)、淋巴细胞数(×109/L)、嗜酸性粒细胞数(×109/L)、嗜酸性粒细胞比(%)、血红蛋白(g/L)水平。

1.2.2细胞因子及受体检测 使用西门子医学诊断产品有限公司生产的IMMULITE 1000全自动化学发光免疫分析仪定量检测研究组患儿及正常对照组儿童血清中细胞因子IL-10、IL-2R及IL-8水平(化学发光法)，具体操作步骤参照IMMULITE 1000操作手册进行实验前的准备、设置、稀释、校准、测定和质控程序。

1.2.3外周血单核细胞制备及RNA提取 取实验组患儿及正常对照组儿童外周静脉血5 ml，肝素钠抗凝，采用Ficoll密度梯度法分离血浆并提取外周血单核细胞，培养基重悬细胞，调整浓度为3×106个/ml。采用TRIzol法提取细胞总RNA，利用PrimeScriptTM逆转录试剂盒(日本TAKARA公司)合成cDNA。引物序列由TAKARA公司合成。IL-10序列信息： 5′-ACATCAAGGCGCATGTGAAC-3′,5′-TA GAGTCGCCACCCTGATGT-3′; IL-2R序列信息：5′-GACAGGCCACACAGATGCTA-3′, 5′-GCTGGGATTC ACTCAGTTTGT-3′; IL-8序列信息：5′-CCACCGGAAGGAACCATCTC-3′；5′-TTCCTTGGGGTCCAGACAGA-3′；GAPDH序列信息：5′-TTCAACGGCACAGTCAAG-3′, 5′-CCAGCATCACCCCATTT-3′。

1.2.4实时荧光定量PCR 使用SYBR®Premix Ex TaqTMII荧光定量试剂盒进行实时荧光定量PCR反应, 具体步骤按照说明书进行。利用Ct值计算目的基因的相对表达量：ΔΔCt=(Ct病例组-CtGAPDH)-(Ct对照组-CtGAPDH)。病例组目的基因mRNA相对表达量=2-ΔΔCt。

1.2.5血清总IgE抗体及食物特异性IgE抗体检测 使用西门子医学诊断产品有限公司生产的IMMULITE 2000 XPi全自动化学发光免疫分析仪定量检测研究组患儿血清中总IgE水平(化学发光法)，具体步骤参照IMMULITE 2000操作手册进行实验前的准备、设置、稀释、校准、测定和质控程序。采用欧蒙医学实验诊断股份公司生产的吸入性及食物性过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒(免疫印迹法)，在体外半定量检测血清中特异性IgE抗体浓度。检测项目：柳树/杨树/榆树、普通豚草、艾蒿、屋尘螨/粉尘螨、屋尘、猫毛、狗上皮、蟑螂、点青霉/分枝孢霉/烟曲霉/交链孢霉、葎草、鸡蛋白、牛奶、花生、黄豆、牛肉、羊肉、鳕鱼/龙虾/扇贝、虾、蟹。

2 结果

2.1 临床特征非IgE组和IgE组食物过敏患儿均以消化道症状及湿疹为主要临床表现，其中非IgE组患儿出现较多的临床症状为腹泻(58.33%)、血便(33.33%)和湿疹(55.56%)；IgE组患儿出现较多的临床症状为腹泻(68.75%)和湿疹(62.50%)。经统计，非IgE组与IgE组患儿临床症状发生率差异无统计学意义，见表2。

表2 非IgE组与IgE组食物过敏患儿临床特征比较[n(%)]

*采用χ2检验，**采用校正χ2检验，#采用Fisher精确概率法

2.2 血细胞学分类与对照组比较，非IgE组与IgE组患儿血淋巴细胞计数及嗜酸性粒细胞计数均显著高于对照组(P<0.05)，非IgE组与IgE组比较，淋巴细胞计数及嗜酸性粒细胞计数差异无统计学意义(P>0.05)，而白细胞计数、嗜酸性粒细胞比例及血红蛋白计数非IgE组、IgE组与对照组两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.3 血清细胞因子及受体水平比较非IgE组患儿血清IL-10水平和外周血单个核细胞IL-10 mRNA水平显著低于对照组和IgE组(P<0.05)，但IgE组IL-10血清水平和细胞mRNA水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。非IgE组和IgE组患儿血清IL-2R以及外周血单个核细胞IL-2R mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)，但非IgE组与IgE组IL-2R水平差异无统计学意义(P>0.05)。此外，非IgE组患儿血清IL-8水平和外周血单个核细胞IL-8 mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)，而IgE组患儿IL-8水平与对照组、非IgE组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4、图1。

血细胞学分类非IgE组(n=36)IgE组(n=16)对照组(n=15)统计量值白细胞计数(×109/L)9.62±2.6510.13±3.058.40±2.731.637淋巴细胞计数(×109/L)5.73±2.24∗5.47±1.84∗3.73±1.895.065嗜酸性粒细胞计数(×109/L)0.47±0.44∗0.45±0.28∗0.21±0.162.911嗜酸性粒细胞比例(%)3.65(3.20)4.22(5.10)3.20(2.20)3.433血红蛋白计数(g/L)118.39±61.60111.25±12.10109.80±14.830.241

与对照组比较：*P<0.05

细胞因子非IgE组(n=36)IgE组(n=16)对照组(n=15)统计量值IL-10(ng/L)3.47(1.38)∗∗#9.20(2.14)14.00(13.61)45.024IL-2R(IU/L)2 048.58±495.79∗1 772.50±888.11∗1 112.00±364.3513.332IL-8(ng/L)22.30(49.70)∗15.10(10.10)13.20(9.20)7.726

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与IgE组比较，#P<0.05

A：非IgE组、IgE组与对照组患儿外周血单个核细胞IL-10 mRNA水平；B：非IgE组、IgE组与对照组患儿外周血单个核细胞IL-2R mRNA水平；C：非IgE组、IgE组与对照组患儿外周血单个核细胞IL-8 mRNA水平；与对照组比较：#P<0.05,##P<0.01；与IgE组比较：*P<0.05

3 讨论

研究[7-8]表明，IL-10血清浓度降低与食物过敏的高风险存在紧密联系。牛奶蛋白过敏患儿游离氨基酸配方干预前血清IL-10水平比干预后显著降低，提示牛奶蛋白过敏患儿体内IL-10水平异常。根据本研究结果显示，非IgE介导的食物过敏中，Tregs活性降低，其分泌IL-10等免疫抑制因子水平较低，不足以调节炎症反应，导致了口服免疫耐受缺陷，从而引起了一系列临床症状，如腹泻、血便等，而IgE介导的食物过敏主要涉及TH2型细胞因子如组胺、IL-4、肿瘤坏死因子α等为主导的I型变态反应，与Tregs活性及IL-10水平高低关系不大。本研究还显示，IgE组患儿血清IL-10水平显著高于非IgE组，推测与体液免疫应答中，IL-10能够增强B细胞上II类表达并诱导免疫球蛋白的生成有关[9]。综上考虑，检测食物过敏患儿血清IL-10水平高低对于初步判断食物过敏免疫类型具有一定的指向性意义。

IL-2结合IL-2R可激活三种不同的信号通路发挥作用[10]。IL-2与Teffs表面IL-2R结合可激活并诱导Teffs，并加强Teffs的杀伤作用(免疫激活)；IL-2与Tregs表面IL-2R结合是维持Tregs细胞存活及发挥作用的必要条件[11](维持免疫耐受)。本研究结果表明，IL-2和IL-2R信号通路在食物过敏中主要表现为免疫激活而非免疫耐受，推测与在IL-2R高表达条件下，Teffs处于高度活化状态，可积极发挥免疫激活作用，而Tregs维持免疫耐受功能并不明显有关，这与本研究中非IgE组患儿血清IL-10水平、IL-10 mRNA水平显著低于对照组相一致。此外，食物过敏患儿血清IL-2R水平均显著升高，表明检测患儿血清IL-2R水平可作为快速明确食物过敏诊断的重要指标之一。

Kimura et al[12]对食物蛋白诱导的小肠结肠炎患儿血清细胞因子进行检测发现，血清中IL-2、IL-5及IL-8水平显著升高，提示IL-2、IL-5和IL-8参与了FPIES相关的免疫应答反应，这与本研究中非IgE组IL-8水平、IL-8 mRNA水平显著高于对照组相一致。然而，IL-8是一种强中性粒细胞趋化因子，其可趋化中性粒细胞定向游走到病灶并释放一系列炎症活性因子，通常认为中性粒细胞浸润是急性炎症反应的特征之一，目前食物过敏发病机制虽尚未完全阐明，但国内外公认食物过敏是免疫介导的变态反应，故而食物过敏并不支持急性炎症反应。因此，对于IL-8在食物过敏患儿血清水平的变化可能需要进一步研究阐明。