锰苯甲酸卟啉在蛛网膜下腔出血早期脑损伤中的保护作用

季 丹，方 琼，黄大可，李 华，吴 芳

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是常见的神经外科急症之一，早期脑损伤在SAH发病后72 h[1-2]。前期动物实验研究[3-4]显示低氧诱导因子-1α、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶可导致大脑水肿、神经元死亡。而N-(6-氧代-5,6-二氢菲啶-2-基)-2-(N,N-二甲基氨基)乙酰胺)、氟西汀可以降低SAH后促炎细胞因子的水平，具有保护神经细胞作用[4-5]。生物活性氧(reactive oxygen species，ROS)主要来源于线粒体，过量的ROS容易导致机体的氧化应激状态，从而产生自由基等细胞毒性物质。锰苯甲酸卟啉[(Mn(Ⅲ)tetrakis(4-Benzoic acid) porphyrin chloride)，MnTBAP]为含有金属锰的锰卟啉药物，它不仅是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)类似物，而且具有清除超氧自由基的作用，且其本身较易透过细胞膜[6]。该研究拟探讨MnTBAP对SAH早期脑损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 SAH大鼠模型的建立本实验采用颈内动脉穿刺法建立大鼠SAH模型，取健康体质量300～350 g 的SPF级SD大鼠100只，钝性分离暴露其右侧颈总动脉(commoncarotidartery，CCA)、颈外动脉(externalcarotidartery，ECA)和颈内动脉(internalcarotidartery，ICA)，结扎切断ECA和ICA之间的吻合支，将ECA结扎、切断拉直，使其与ICA成一直线。采用直径0.26 mm锐化尼龙线从颈外动脉插入颈内动脉的颅内段，感觉有阻力时继续插入3 mm，造成蛛网膜下腔出血。迅速拔尼龙线，颈外动脉残端结扎，妥善处理颈部切口。采集脑组织标本时如见基底池、枕大池、脑干、小脑或者大脑表面有血凝块存在则认为模型成功。见图1。

图 1 各组大体标本A：空白对照组；B：假手术组；C：模型组；D：实验组

1.2 实验动物分组SD大鼠被随机分为空白对照组、假手术组、模型组和实验组，每组25只。假手术组大鼠经相同的手术过程，但不穿破血管壁，其余操作均与SAH组一致。参考既往文献[7]，实验组大鼠行腹腔注射MnTBAP 10 mg/kg。

1.3 检测指标

1.3.1神经功能缺陷评分 参照Garcia制定后经Kusaka et al[8]修订的标准，于术后24 h评估各组动物的自发性活动、四肢运动对称、前脚伸展、攀登、双侧躯干的触碰反应和触须反应。

1.3.2脑组织含水含量测定 术后24 h，分离大脑并保持蛛网膜的完整性。对大脑的湿重进行测量并记录，后将大脑放入烤箱内进行120 ℃烘烤，24 h后测量干重。用干湿重法计算脑组织含水量(脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%)。

1.3.3血脑屏障通透性测定 使用Evans蓝外渗实验评定。SAH建模成功后24 h，股静脉注射2%Evans蓝(2 mg/kg)，1 h后开胸灌注后迅速断头取脑。后行荧光光度测定法测定外渗Evans蓝量，以ng/mg表示。

1.3.4Western blot 法检测 术后24 h采集大鼠大脑组织，蛋白质液裂解并提取总蛋白，提取的蛋白标本采用BCA试剂盒测定其浓度。每孔取20 μg蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，其后转膜，加一抗4 ℃过夜线粒体三磷酸腺苷合成酶6亚基(adenosine triphosphatase-6，ATPase-6)抗体(购自美国Abcam公司)、细胞色素C(Cytochrome C，Cytc)抗体(购自美国Santa Cruz公司)和β-actin抗体(购自美国Invitrogen公司)，加HRP标记的二抗，ECL法显影，X线胶片记录。

1.3.5MDA含量、SOD和GSH-Px活性测定 术后24 h，取大鼠大脑组织裂解、匀浆、离心、蛋白定量后，按照各试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)操作说明书，分别检测大脑组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性。

2 结果

2.1 各组神经功能缺陷评分比较空白对照组和假手术组大鼠神经功能均无明显损伤，而模型组和实验组神经功能均有一定程度的损伤。见表1。模型组的神经功能缺陷评分明显低于空白组、假手术组和实验组，差异有统计学意义(P均<0.05)，实验组与空白组、假手术组之间的神经功能缺陷评分差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组脑组织含水量比较模型组的脑组织含水量明显高于空白组、假手术组和实验组，差异有统计学意义(P均<0.05)，实验组与空白组及假手术组之间的神经功能缺陷评分差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

2.3 各组血脑屏障通透性比较空白组和假手术组大脑表面和周围血管颜色正常，而模型组颞底皮层呈现显著的蓝色，而实验组亦在颞底皮层有蓝色呈现，但显示的蓝色程度较模型组弱。见图2。Evans蓝渗出量测定验证了大体观测，模型组和实验组的Evans蓝渗出量明显高于空白组和假手术组，差异有统计学意义(P均<0.05)，实验组的Evans蓝渗出量明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白组和假手术组之间的Evans蓝渗出量差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

图2 各组血脑屏障通透性实验A：空白对照组；B：假手术组；C：模型组；D：实验组

2.4 各组ATPase-6、细胞色素C表达MnTBAP抑制Cytc的表达和增加了ATPase-6的表达水平，实验组与空白组、假手术组两组蛋白表达量差异无统计学意义。见图3。

表1 各组神经功能缺陷评分、脑组织含水量和Evans蓝渗出量

与模型组比较：*P<0.05；与实验组比较：#P<0.05

图3 各组Western blot结果A：各组ATPase-6和Cytc蛋白电泳示意图； B：各组ATPase-6蛋白定量示意图； C：各组Cytc蛋白定量示意图

指标空白组假手术组模型组实验组F值MDA(nmol/mg)2.8±0.2∗#3.1±0.4∗#5.2±0.53.8±0.5∗3.41SOD(U/mg)27.5±2.9∗#26.8±2.4∗#15.4±3.222.6±2.7∗5.16GSH-Px(U/mg)7.6±1.8∗#7.4.±1.5∗#3.4±1.15.6±1.4∗6.27

与模型组比较：*P<0.05；与实验组比较：#P<0.05

2.5 各组MDA含量、SOD和GSH-Px活性模型组和实验组的MDA含量明显高于空白组和假手术组，差异有统计学意义(P均<0.05)，模型组和实验组的SOD活性和GSH-Px活性明显高于空白组和假手术组，差异有统计学意义(P均<0.05)，实验组的MDA含量明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，实验组的SOD活性和GSH-Px活性明显高于模型组，差异有统计学意义(P均<0.05)，而空白组和假手术组之间的MDA含量、SOD和GSH-Px活性差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨论

综上，本实验表明MnTBAP在SAH早期脑损伤中可能具有神经保护作用，其具体的作用机制课题组将继续深入探讨。