EZH2抑制剂DZNep对NK/T淋巴瘤细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

张 梓，夏莎莎，夏瑞祥

人NK/T淋巴瘤是一种特殊类型的非霍奇金淋巴瘤，以鼻和面部中线部位破坏为主要表现，且有明显的地域和种族易感性，多发于亚洲及南美洲，具有侵袭性高、预后差、复发率高等特点[1]。果蝇Zeste基因增强子人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)是多梳抑制复合体2(polycomb repressive complex 2, PRC2)中的核心亚基，具有组蛋白甲基化酶活性，能催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(trimethylation of histone H3 lysine27, H3K27me3)，在表观遗传学水平调控基因的表达[2]。而EZH2抑制剂DZNep (3-deazaneplanocin)作为EZH2蛋白的靶向抑制剂，能抑制EZH2的组蛋白甲基化酶活性，并能降解EZH2蛋白[3]。最新研究证实，EZH2在NK/T淋巴瘤组织中表达显著增高，且与肿瘤细胞的异常增殖密切相关[4]。目前，在对NK/T淋巴瘤的研究中，针对EZH2的靶向治疗鲜有报道，据此，该研究拟用EZH2抑制剂DZNep作用人NK/T淋巴瘤细胞株SNK-6，观察其对EZH2蛋白水平的影响以及对SNK-6细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，进而为该肿瘤的靶向治疗提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞系 人NK/T淋巴瘤细胞SNK-6细胞株购自上海信裕生物科技有限公司。

1.1.2药品与主要试剂 DZNep购自美国APExBIO公司，以DMSO溶解储存备用；RPMI 1640培养液、胎牛血清购自美国HyClone公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒、PI染色细胞周期检测试剂盒均购自上海贝博公司；兔抗人EZH2、Cleaved PARP单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗人Cleaved Caspase-3抗体购自英国Abcam公司；兔抗人β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自武汉塞维尔科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将NK/T淋巴瘤细胞株SNK-6置于含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，细胞呈悬浮生长，每2～3 d换液并传代，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2CCK-8法检测细胞增殖 将SNK-6细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中，用不同浓度(0.2、0.5、1、2、5 μmol/L)DZNep处理细胞，同时设对照组(不加药物，加入等量DMSO)及空白组(只含培养液，无细胞)，每组设3个复孔，培养24、48、72 h后，加入CCK-8溶液，在培养箱孵育2 h后，用酶标仪测出波长为450 nm的吸光度(A450)值。实验重复3次，取平均值，根据公式计算细胞增殖抑制率(%)=[1-(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%，以药物浓度为横轴，细胞增殖抑制率为纵轴，绘制细胞生长曲线。

1.2.3PI染色流式细胞术检测细胞周期 将细胞以1×106/ml的浓度接种于6孔板中，用不同浓度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep处理细胞，并设立对照组(不加药物，加入等量DMSO)，培养48 h后，离心(1 500 r/min，5 min)收集细胞，冷PBS洗涤2次，用500 μl PBS重悬细胞，滴加5 ml冷乙醇4 ℃固定过夜，离心(2 000 r/min，10 min)收集细胞，冷PBS 洗涤2次，用500 μl冷PBS重悬细胞后加入Rnase A溶液20 μl，37 ℃水浴30 min，离心(2 000 r/min，10 min)收集细胞，加入400 μl PI染液重悬细胞，4 ℃避光孵育30 min，立即用流式细胞仪(BD FACSVerse)检测细胞周期，用FlowJo软件分析细胞周期百分比。

1.2.4Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞以2×105/ml的浓度接种于6孔板中，用不同浓度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep处理细胞，并设立对照组(不加药物，加入等量DMSO)，培养48 h后，离心(1 000 r/min，4 ℃，5 min)收集细胞，冷PBS洗涤2次，用400 μl×Annexin V结合液悬浮细胞，密度大约为1×106/ml，加入5 μl Annexin V-FITC染色液，4 ℃避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液，4 ℃避光孵育5 min，立即用流式细胞仪(BD FACSVerse)检测细胞凋亡率，用FlowJo软件分析凋亡率。

1.2.5Western blot检测 收集不同浓度DZNep处理48 h后的SNK-6细胞，用全细胞蛋白提取试剂盒提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒定量，加入上样缓冲液，行SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF 膜上，使用5%脱脂奶粉封闭液室温封闭2 h，TBST溶液速洗几次，加入EZH2、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP及β-actin一抗(1 ∶1 000稀释)4 ℃ 孵育过夜，次日用TBST溶液洗3次，加入二抗(1 ∶10 000稀释)室温孵育2 h，TBST溶液洗3次，ECL化学发光法曝光、显影，用ImageJ分析软件分析各条带灰度值，目的蛋白的相对表达量以目的蛋白/内参β-actin的灰度值表示。

2 结果

2.1 DZNep能抑制SNK-6细胞增殖不同浓度(0.2、0.5、1、2、5 μmol/L)DZNep分别处理SNK-6细胞24、48、72 h后，细胞增殖均受到不同程度抑制，各加药组与对照组比较差异均有统计学意义(F=192.869、1 469.000、3 210.000，P<0.01)，且DZNep对SNK-6细胞株的增殖抑制作用存在时间-剂量依赖关系，见表1、图1。

表1 CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率(%,n=3)

与对照组比较:**P<0.01

图1 DZNep抑制 SNK-6细胞的增殖

2.2 DZNep能诱导SNK-6细胞发生G1/S期阻滞不同浓度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep处理SNK-6细胞48 h后，统计得G1期细胞百分比分别为(41.25±1.76)%、(46.40±2.03)%、(54.78±1.18)%，S期细胞百分比分别为(52.47±0.68)%、(41.67±1.28)%、(36.70±1.54)%，对照组G1期和S期细胞百分比分别为(33.40±1.69)%、(60.21±0.82)%，各加药组与对照组比较，G1期细胞百分比升高，差异有统计学意义(F=56.296，P<0.01)，S期细胞百分比下降，差异有统计学意义(F=175.098，P<0.01)，且均具有剂量依赖性，见图2。

2.3 DZNep能诱导SNK-6细胞发生凋亡不同浓度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep处理SNK-6细胞48 h后，统计得细胞凋亡率分别为(15.09±0.89%)、(23.37±1.11)%、(47.54±1.61)%，对照组细胞凋亡率为(4.42±0.34)%，各加药组与对照组比较，细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(F=566.955，P<0.01)，且随着药物浓度升高，细胞凋亡率逐渐增加，呈剂量依赖性，见图3。

图2 DZNep诱导SNK-6细胞 G1/S期阻滞

2.4 DZNep降解EZH2蛋白并诱导Cleaved Caspase-3及Cleaved PARP的产生不同浓度(0.2、1、5 μmol/L)DZNep处理SNK-6细胞48 h后，EZH2蛋白水平呈下降趋势，与对照组相比，差异有统计学意义(F=7 457.000,P<0.01)；Cleaved Caspase-3蛋白的相对表达量逐渐上升，与对照组比较，差异有统计学意义(F=893.251,P<0.01)；Cleaved PARP蛋白的相对表达量逐渐上升，与对照组比较，差异有统计学意义(F=1 118.000,P<0.01)，且均具有剂量依赖性，见图4。

图3 DZNep诱导SNK-6细胞发生凋亡

3 讨论

NK/T淋巴瘤具有恶性度高、侵袭性强，预后不佳等特点，其发病机制尚不完全清楚，现已知与EB病毒感染密切相关，因多原发于鼻腔，故又称鼻型NK/T淋巴瘤。该病以血管中心性浸润为特点，并伴有明显的血管损伤和组织坏死。治疗上，早期以局部放疗为主，晚期以全身化疗为主，化疗方案可选择以左旋门冬酰胺酶为主的联合化疗方案，高危和复发难治的患者则可考虑自体或异基因造血干细胞移植治疗，但目前国际上仍无明确有效的治疗方案[5]。故进一步探究其发病机制以及寻求新的治疗思路尤为重要。

图4 DZNep降解EZH2蛋白并诱导Cleaved

EZH2基因位于染色体7q35～36上，包含20个外显子和19个内含子， EZH2蛋白由746个氨基酸构成，具有组蛋白甲基化酶的活性，EZH2催化的组蛋白甲基化常与其他表观遗传学修饰，如DNA甲基化、组蛋白去乙酰化等相关联，共同发挥致癌作用[2]。近年来，研究[6-7]显示EZH2在前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中存在表达异常，且与肿瘤的发生、发展、预后以及耐药性密切相关，其作用机制复杂多样，具有特异性。在NK/T淋巴瘤中也存在EZH2表达上调的现象，但其并不是通过经典的H3K27me3途径发挥致癌作用，而是作为转录激活因子结合到Cyclin D1的启动子上，直接激活Cyclin D1的表达，进而导致肿瘤细胞的异常增殖[4]。本课题组前期研究[8]显示干扰EZH2基因可以增强NK/T淋巴瘤的化疗敏感性。

DZNep是一种3-去氮腺苷的环戊醇类似物，它是第一个被发现的EZH2抑制剂。DZNep能有效抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH)水解S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，SAH)，引起细胞内SAH的积聚，并抑制S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)依赖的组蛋白甲基转移酶活性，同时，DZNep能诱导EZH2的降解[3]。目前，在对前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤的体外实验[9-11]显示，DZNep能通过干扰组蛋白修饰及miRNA等多种途径抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。

本实验选择用EZH2抑制剂DZNep作用于SNK-6细胞株，观察其对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。DZNep在0.2～5 μmol/L的范围内可有效抑制SNK-6细胞株的增殖，并存在时间-剂量依赖性。同时，DZNep能诱导G1/S期阻滞，细胞周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂完成的全过程，包括分裂期和分裂间期两个部分，分裂间期又包括DNA合成前期(G1期)，DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)。G1/S期转换是指细胞由DNA复制前的物质、能量准备阶段进入DNA复制阶段，G1/S期转换失控是癌变的关键步骤[12]。本实验结果表明DZNep能通过阻滞G1/S期转换来抑制细胞异常增殖。细胞凋亡是细胞生理性的自发死亡，受多种基因和信号通路的严密调控，诱导细胞凋亡是肿瘤治疗中的重要策略。本实验运用Annexin V/PI双染流式细胞术证明DZNep能有效诱导SNK-6细胞发生凋亡。同时，Western blot结果显示，随着药物剂量的增加，Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP水平呈上升趋势。Cleaved Caspase-3是Caspase-3的激活形式，Caspase-3作为凋亡执行的关键蛋白，正常情况下以无活性酶原的形式存在于胞质中，当凋亡启动时，Caspase-3被剪辑激活成Cleaved Caspase-3，而PARP作为Cleaved Caspase-3的底物，又被进一步剪辑成Cleaved PARP。PARP具有DNA修复酶的功能，剪辑后的PARP丧失了DNA修复能力，促进了凋亡的发生。Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP作为凋亡发生的分子标志，其表达量的增加再次表明DZNep能诱导凋亡的发生。除此之外，随着DZNep浓度的增加，EZH2蛋白水平呈下降趋势，证明DZNep能有效降解EZH2蛋白。

以上实验结果初步表明，DZNep能降解EZH2蛋白，并在体外抑制SNK-6细胞的增殖、诱导G1/S期阻滞、诱导凋亡发生并促进Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP的产生。该结果为NK/T淋巴瘤的靶向治疗提供了一定的参考，此后需完善其相关分子机制及上下游信号通路的研究，同时可进一步探究DZNep与常规化疗药物的联合应用效果，为NK/T淋巴瘤的治疗提供更多的思路。