褪黑素对高糖刺激系膜细胞NF-κB与TGF-β/Smad3通路的影响

马 玉 ，杨雯雯，范 哲，吴永贵，夏玲玲

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最严重和最常见的并发症之一。肾小球肥大、基底膜增厚和多种细胞外基质沉积是DN的病理学基础，最终导致肾小球和肾间质纤维化[1]。大量研究发现系膜细胞(mesangial cells, MCs)中核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)在DN炎症及纤维化的进展中发挥关键作用[2-3]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可激活其下游Smad3途径诱导细胞外基质Ⅳ型胶原(collagenⅣ，Col Ⅳ)和纤连蛋白(fibronectin，Fn)分泌增加，导致肾脏纤维化[4-5]。褪黑素(melatonin, MT)是由松果体产生的吲哚，具有抗氧化和抗炎的特性。研究[6]显示MT可以抑制肾脏炎症发挥肾脏保护作用；另有研究[7]证实MT通过抑制NF-κB信号通路从而降低炎症的产生。该研究旨在探讨在MCs中MT是否通过NF-κB及TGF-β/Smad3通路抑制纤维化因子的产生，为DN的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料MCs SV40 MES13细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；MT、甘露醇、高糖购自美国sigma公司；DMEM1.0培养基、胎牛血清、青链霉素混合液购自美国Thermo Scientific公司；BCA蛋白测定试剂盒购自上海碧云天生物工程研究所；CCK-8试剂盒和SYBR Green PCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；小鼠Col Ⅳ和Fn 酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自武汉华美生物科技有限公司；兔抗NF-κBp65单克隆抗体、鼠抗核因子κB抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)单克隆抗体、鼠抗p-IκB单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，兔抗Smad3多克隆抗体和兔抗p-Smad3多克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗Col Ⅳ多克隆抗体、兔抗Fn多克隆抗体和小鼠抗β-actin单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 将液氮中冻存的系膜细胞取出，在37 ℃的水浴锅中迅速融化，转移至10 ml的离心管中，加5～6 ml培养液吹打混匀，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加5 ml培养液吹打重悬后，接种至含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM1.0的培养基中常规培养。

1.2.2实验分组 将细胞分为：甘露醇对照组，正常对照组(糖浓度为5 mmol/L)，正常对照+MT组，高糖组(糖浓度为25 mmol/L)，高糖+10 μmol/L MT组，高糖+100 μmol/L MT组，高糖+1 000 μmol/L MT组。

1.2.3CCK-8检测细胞活性 将浓度为1×105个/ml细胞悬液接种于96孔板，每孔加入100 μl，无细胞组和空白对照组加单纯培养基100 μl，37 ℃培养24 h。弃去培养基，按实验分组加入不同刺激药物，培养基其它成分与正常对照组相同，培养24 h后，按照CCK-8试剂盒说明书检测系膜细胞活性情况。

1.2.45-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)检测细胞增殖 将浓度为1×104个/ml细胞悬液接种于6孔板，常规培养。按照实验分组加药刺激后，继续培养24 h，加入2×EdU 工作液，孵育30 min，弃去培养液，加入4%多聚甲醛细胞固定液，孵育15 min,弃去细胞固定液，含 3% BSA 的 PBS漂洗2次，加入PBST，室温孵育 20 min，每孔加入100 μl iClick 反应液，避光，室温孵育30 min, 1 × Hoechst 33342 染色液避光染色15 min，封片，激光共聚焦显微镜(LSM880，购自德国卡尔蔡司)拍照观察。

1.2.5激光共聚焦检测NF-κBp65核转移及Col Ⅳ和Fn的表达 将适宜浓度的细胞悬液加入装有盖玻片的6孔板中，常规培养。按照实验分组每组加入不同刺激物，继续培养24 h，4%多聚甲醛固定5 min，0.5% TRItonx-100孵育15 min，5%驴血清4 ℃封闭2 h，加入兔抗NF-κBp65、兔抗Col Ⅳ及兔抗Fn的一抗4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3遍，每遍5 min，然后加入荧光二抗，常温避光孵育2 h，DAPI染液染核10 min，封片，激光共聚焦显微镜观察采像。

1.2.6ELISA检测细胞因子表达水平 收集各组细胞上清液，按照各ELISA试剂盒说明书进行。

1.2.7qRT-PCR检测细胞因子mRNA表达水平 收集各组细胞，采用TRIzol法提取各组细胞mRNA,加入4 μl 5 × HiScript Ⅱ qRT SuperMix、1 μg模板RNA、RNase free ddH2O配制成20 μl混合液，逆转录条件第一步50 ℃、 15 min，第二步8 ℃、5 s，合成cDNA。按SYBR Green PCR试剂盒检测Col Ⅳ和Fn mRNA表达，引物序列见表1。加入10 μl 2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、0.4 μl Primer1(10 μmol/L)、0.4 μl Primer2(10 μmol/L )、0.4 μl 50×ROX Reference Dye 2、2 μl DNA模板、ddH2O配制成20 μl混合液，按第一步95 ℃、5 min，1个循环；第二步95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40个循环；第三步95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，1个循环的条件进行反应。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)GAPDH作为内参，用2-ΔΔCT法计算。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.2.8Western blot检测细胞蛋白表达 收集各组细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，加上样缓冲液煮沸10 min后，取40 μg蛋白上样，经8%～12%SDS-PAGE凝胶电泳，湿电转至硝酸纤维膜上，丽春红显色，5%脱脂牛奶-PBST溶液4 ℃封闭2 h，分别加入Col Ⅳ(1 ∶500)、Fn(1 ∶1 000)、TGF-β1(1 ∶1 000)、Smad3(1 ∶1 000)、p-Smad3(1 ∶1 000)、IκB(1 ∶1 000)、p-IκB(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶35 000)，4 ℃过夜，PBST洗3次，每次10 min，加入对应二抗(1 ∶10 000)，室温孵育45 min，洗膜，显影。采用β-actin作为内参，系统软件Image-J进行灰度分析。

2 结果

2.1 CCK-8检测各组MCs活性与正常对照组相比，高糖组、高糖+1 μmol/L MT组、高糖+10 μmol/L MT组、高糖+100 μmol/L MT组、高糖+1 000 μmol/L MT组MCs活性未受影响(P>0.05)；高糖+10 000 μmol/L MT组MCs的活性降低(F=53.010，P<0.05)。见图1。

2.2 EdU检测各组MCs增殖情况及激光共聚焦检测NF-κBp65亚基入核在MCs增殖检测中，与正常对照组比较，甘露醇对照组和正常对照+MT组的红色荧光表达无差异，高糖组红色荧光表达明显增强；与高糖组相比，高糖+10 μmol/L MT组、高糖+100 μmol/L MT组、高糖+1 000 μmol/L MT组红色荧光强度均下降，其中MT干预组的荧光下降程度与MT浓度呈正相关。在NF-κBp65入核检测中，与正常对照组相比，高糖组NF-κBp65的绿色荧光显著增强，且入核明显增多；与高糖组比较，高糖+10 μmol/LMT组、高糖+100 μmol/L MT组、高糖+1 000 μmol/L MT组NF-κBp65绿色荧光强度及入核均呈浓度依赖性降低。见图2。

图1 MT对高糖刺激MCs活性的影响

A：正常对照组；B：高糖组；C：高糖+1 μmol/L MT组；D：高糖+10 μmol/L MT组；E：高糖+100 μmol/L MT组；F：高糖+1 000 μmol/L MT组；G：高糖+10 000 μmol/L MT组；与正常对照组比较：*P<0.05

图2 共聚焦显微镜下各组MCs 增殖及

A：甘露醇对照组；B：正常对照组；C：正常对照+MT组；D：高糖组；E：高糖+10 μmol/L MT组；F：高糖+100 μmol/L MT组；G：高糖+1 000 μmol/L MT组

2.3 激光共聚焦检测各组MCs Col Ⅳ、Fn的表达与正常对照组比较，甘露醇对照组和正常对照+MT组Col Ⅳ 绿色荧光、Fn红色荧光强度无差异，高糖组荧光强度明显增强；与高糖组相比，高糖+10 μmol/L MT组、高糖+100 μmol/L MT组、高糖+1 000 μmol/L MT组的荧光强度均下降，其中MT干预组的荧光下降程度与MT浓度呈正相关。见图3。

图3 共聚焦显微镜下各组MCs Col Ⅳ、Fn表达情况 ×630

A：甘露醇对照组；B：正常对照组；C：正常对照+MT组；D：高糖组；E：高糖+10 μmol/L MT组；F：高糖+100 μmol/L MT组；G：高糖+1 000 μmol/L MT组

2.4 ELISA检测各组MCs上清液中Col Ⅳ、Fn表达水平与正常对照组比较，甘露醇对照组和正常对照+MT组收取的培养基上清液中所含Col Ⅳ和Fn水平差异无统计学意义，高糖组纤维化因子Col Ⅳ和Fn水平明显上升(P<0.05)；与高糖组相比，高糖+10 μmol/L MT组Col Ⅳ水平降低，但差异无统计学意义，高糖+100 μmol/L MT组、高糖+1 000 μmol/L MT组Col Ⅳ水平均明显降低，其降低程度与MT浓度呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组相比，高糖+10 μmol/L MT组、高糖+100 μmol/L MT组、高糖+1 000 μmol/L MT组Fn水平均显著下降，其降低程度与MT浓度呈正相关，差异有统计学意义(FCol Ⅳ= 60.438，FFn=2 074.666，P<0.05)。见表2。

2.5 qRT-PCR检测各组MCs Col Ⅳ和Fn mRNA表达变化与正常对照组比较，甘露醇对照组和正常对照+MT组Col Ⅳ和Fn mRNA转录表达差异无统计学意义，高糖组Col Ⅳ和Fn mRNA表达明显增加(P<0.05)；与高糖组相比，高糖+10 μmol/L MT

表2 各组上清液中Col Ⅳ、Fn含量

A：甘露醇对照组；B：正常对照组；C：正常对照+MT组；D：高糖组；E：高糖+10 μmol/L MT组；F：高糖+100 μmol/L MT组；G：高糖+1 000 μmol/L MT组；与正常对照组比较：*P<0.05；与高糖组比较：#P<0.05

组、高糖+100 μmol/L MT组、高糖+1 000 μmol/L MT组mRNA转录均明显降低，其降低程度与MT浓度呈正相关，差异有统计学意义(FCol Ⅳ=61.011，FFn=16.287，P<0.05)。见图4。

图4 qRT-PCR检测各组MCs Col Ⅳ、Fn mRNA表达

A：甘露醇对照组；B：正常对照组；C：正常对照+MT组；D：高糖组；E：高糖+10 μmol/L MT组；F：高糖+100 μmol/L MT组；G：高糖+1 000 μmol/L MT组；与正常对照组比较：*P<0.05；与高糖组比较：#P<0.05

2.6 Western blot检测各组MCs Col Ⅳ、Fn、p-IκB/IκB、TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表达与正常对照组比较，甘露醇对照组和正常对照+MT组Col Ⅳ、Fn、p-IκB/IκB、TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表达无统计学意义，高糖组各蛋白表达明显增强(P<0.05)；高糖+10 μmol/L MT组、高糖+100 μmol/L MT组、高糖+1 000 μmol/L MT组各蛋白表达与高糖组相比均降低，其降低程度与MT浓度呈正相关，差异有统计学意义(FCol Ⅳ=231.419，FFn=403.166，Fp-IκB/IκB=785.722，FTGF-β1=107.384，Fp-Smad3/Smad3=178.465，P<0.05)。见图5、6、7。

3 讨论

DN是糖尿病患者死亡的主要原因，它是一种原发性慢性微血管病变，微炎症和随后的细胞外基质增加是DN进展的主要途径[5, 8]。MCs作为肾脏重要组成细胞之一，具有收缩、吞噬、增殖、合成系膜基质和胶原的功能。高血糖是DN发生的启动因素，越来越多的研究[3, 9]表明，高糖刺激可以诱导MCs分泌Col Ⅳ和Fn增加，引起肾脏纤维化。本实验采用高糖刺激MCs，模拟糖尿病高糖微环境，结果显示，与正常糖浓度对照组相比，高糖组MCs增殖明显上调，促纤维化细胞因子 TGF-β1及细胞外基质Col Ⅳ和Fn表达明显增强。

图5 Western blot检测各组MCs Col Ⅳ、Fn 蛋白表达

A：甘露醇对照组；B：正常对照组；C：正常对照+MT组；D：高糖组；E：高糖+10 μmol/L MT组；F：高糖+100 μmol/L MT组；G：高糖+1 000 μmol/L MT组；与正常对照组比较：*P<0.05；与高糖组比较：#P<0.05

图6 Western blot检测各组MCs p-IκB/IκB蛋白表达

A：甘露醇对照组；B：正常对照组；C：正常对照+MT组；D：高糖组；E：高糖+10 μmol/L MT组；F：高糖+100 μmol/L MT组；G：高糖+1 000 μmol/L MT组；与正常对照组比较：*P<0.05；与高糖组比较：#P<0.05

图7 Western blot检测各组MCs TGF-β1、

A：甘露醇对照组；B：正常对照组；C：正常对照+MT组；D：高糖组；E：高糖+10 μmol/L MT组；F：高糖+100 μmol/L MT组；G：高糖+1 000 μmol/L MT组；与正常对照组比较：*P<0.05；与高糖组比较：#P<0.05

NF-κB在炎症的发生发展中发挥重要作用。未受刺激时，NF-κB游离存在胞质中，一旦受到刺激，NF-κB 便移位于细胞核中并促进多种炎症因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素1β和单核细胞趋化因子1的释放,并且促进促纤维化因子TGF-β1的产生[2,10]。TGF-β/Smad3信号通路是参与胶原产生的关键信号通路之一，促纤维化因子TGF-β1的激活以及细胞外基质Col Ⅳ和Fn的产生，导致肾小球系膜基质积聚，肾小管间质硬化[11]。既往研究[4, 12]显示，抑制TGF-β/Smad3信号通路可以预防肾纤维化。在本实验中，通过激光共聚焦显微镜观察到，高糖组的NF-κBp65荧光强度明显增强，入核明显增加；Western bolt显示p-IκB/IκB蛋白表达显著升高，TGF-β1和p-Smad3/Smad3的蛋白表达也明显上调。可以推测出高糖刺激可以增强NF-κBp65入核，并且激活TGF-β/Smad3信号通路使MCs外基质Col Ⅳ和Fn的分泌明显增加。

MT主要由松果体产生，前期研究[13-14]显示MT具有抗氧化，抗炎和抗细胞凋亡等多种药理活性。近期研究[14]表明MT对DN具有保护作用，但具体的保护机制仍是不明确的。本实验采用高糖模拟糖尿病微环境，刺激MCs，观察到MT对高糖刺激的MCs的增殖起到抑制作用，抑制 NF-κBp65入核，减少促纤维化因子TGF-β1、细胞外基质Col Ⅳ和Fn的合成分泌，这些证实了MT具有抗纤维化作用；同时观察到MT对正常糖浓度下MCs的增殖、NF-κBp65入核、TGF-β/Smad3信号通路及Col Ⅳ和Fn的分泌无影响，由此可以推测MT是通过抑制高糖刺激下NF-κBp65入核及TGF-β/Smad3信号通路上调抑制MCs分泌Col Ⅳ和Fn。

综上所述，高糖刺激可以导致MCs增殖，并且诱导MCs的NF-κBp65入核及TGF-β/Smad3信号通路激活，从而促进Col Ⅳ和Fn的分泌；MT可以抑制高糖诱导的MCs增殖，并且通过干预MCs 的NF-κBp65核转位及TGF-β/Smad3信号通路上调从而降低高糖引起的Col Ⅳ和Fn的分泌。本研究参考了大量国内外文献，发现系膜的增生及Col Ⅳ和Fn的分泌可引起糖尿病肾病肾脏的纤维化，但机制尚未阐明，此研究深入探讨了相关机制，发现MCs增殖及外基质的分泌可能与NF-κB及TGF-β/Smad3通路相关，MT可通过抑制NF-κB及TGF-β/Smad3信号通路从而减弱高糖刺激下MCs的增殖及外基质的分泌，为DN肾脏纤维化提供了新的思路与视角，但此作用是否同时与其他信号通路有关还需深入研究。