miR-451a促进胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性

常振宇，张亚楠，刘婕，丁丽华，刘荣

1.解放军总医院 肝胆外二科，北京 100853；2.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100850

胰腺癌是具有高度恶性的消化系统肿瘤，早期诊断困难，预后极差，总体五年生存率尚不足10%[1]。目前针对胰腺癌的治疗手段相对有限，手术是惟一能达到根治性治疗的手段，但仅有10%～15%的病人有机会进行手术治疗，化疗仍然是胰腺癌治疗的主要手段[2]。以吉西他滨为基础的方案是临床上辅助、新辅助、局部晚期以及转移性病变的一线化疗方案，吉西他滨可以明显改善胰腺癌患者的预后，但由于原发性和继发性耐药的发生，只有少部分病人能从化疗中得到真正的临床获益[3]。

microRNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，长度为17～25个核苷酸，在肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用[4]。近期研究发现多种miRNA在肿瘤化疗耐药中也发挥重要功能，如miR-21在多种肿瘤中调控细胞对顺铂、紫杉醇、多柔比星等不同化疗药物的敏感性[5-7]；miR-34a表达水平下调会导致结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药[8]，在前列腺癌细胞中，miR-34a上调会增加耐药细胞对紫杉醇的敏感性[9]。相关研究表明胰腺癌吉西他滨耐药也同样受miRNA所调控，miR-101-3p可以通过抑制核糖核苷还原酶调节因子1（RRM1）的表达，增加胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性[10]；而miR-320c则可以通过SMARCC1诱导胰腺癌对吉西他滨耐药[11]。目前多项研究显示了miRNA与胰腺癌吉西他滨耐药的相关性，但吉西他滨耐药机制复杂，许多miRNA在其中的作用尚不明确，因此探索在耐药调控中发挥功能的新的miRNA，有助于我们了解吉西他滨耐药的原因，有可能为克服吉西他滨耐药提供新的思路。

在本研究中，我们通过miRNA测序，筛选发现在胰腺癌吉西他滨耐药细胞株中miR-451a表达水平明显下调，推测miR-451a可能在耐药过程中发挥作用。因此，我们进一步通过体外细胞实验和体内动物实验验证了miR-451a在胰腺癌吉西他滨耐药中的功能。

1 材料与方法

1.1 材料

6周龄雌性BALB/c裸鼠购自北京维通利华公司；人胰腺癌细胞系CFPAC-1、PANC-1购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；DMEM、IMDM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；吉西他滨购自上海陶素生化公司；转染试剂RNAimax购自Themo Fisher公司；RNA抽提试剂TRI Reagent购自Sigma公司；反转录酶MMLV、实时荧光定量PCR试剂TB Green Premix购自TaKaRa公司；CCK8试剂盒购自日本东仁化学公司；细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司；miR-451a类似物（细胞实验用mimics和动物实验用agomir）合成于苏州吉玛基因公司；反转录及qPCR引物由北京博迈德基因技术公司合成。

1.2 耐药细胞株的获取

采用低浓度梯度递增法。在CFPAC-1细胞的完全培养基中加入吉西他滨，起始药物浓度为1 μmol/L，处理48 h后更换为不含药物的完全培养基，培养48 h后重新加入药物处理，1周后增加药物浓度。药物处理5个月后，在含低浓度（1 μmol/L）吉西他滨的培养基中培养并稳定传代10代以上，获取耐药细胞株（CFPAC-1 GemR），并利用细胞存活实验鉴定耐药效果。

1.3 RNA提取及测序

收取目的细胞，用1×PBS清洗1次，加入TRI Reagent 1 mL吹打裂解，室温静置5 min，加入200 μL氯仿充分混匀，静置 5 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，可见分层，吸取上层液体至新的EP管中，加入400 μL异丙醇混匀，室温静置10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，可见RNA沉淀，去上清，依次用75%乙醇、无水乙醇清洗，室温充分干燥后加入40 μL DEPC处理水溶解，Nanodrop测定RNA浓度及纯度，电泳鉴定降解情况，质量合格后用于下游反转录或测序。野生型CFPAC-1及耐药细胞株的miRNA测序及数据分析由北京诺禾致源公司完成。

1.4 反转录及实时荧光定量PCR

miRNA的反转录采用茎环法，通用茎环序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGAC。取RNA 2 μg、miRNA特异性反转录引物 0.5 μg，加水稀释至16 μL，70℃结合 5 min后置于冰上，加入MMLV反转录酶和对应缓冲液、dNTP及RNase抑制剂，42℃反应1 h，95℃5 min灭活，得到cDNA第一链，稀释至100μL，用于下游qPCR反应。miRNA特异性反转录引物见表1。

采用 20 μL qPCR 体系（TB Green Premix 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 模板 9.2 μL），每组设3个重复孔，在Bio-Rad CFX96PCR仪上进行反应，下游引物为通用反向引物，U6作为内参，用2-ΔΔCt法计算miRNA的相对表达量。

表1 miRNA特异性反转录引物

表2 qPCR引物

1.5 miRNA类似物转染

将CFPAC-1和PANC-1细胞接种于6孔板，转染密度达50%～70%为宜。取7.5 μL RNAimax试剂，用无血清无双抗的DMEM稀释至150 μL；miRNA mimics（20 μmol/L）3 μL，无血清无双抗的DMEM稀释至150 μL；将稀释后的转染试剂和miRNA mimics充分混匀后室温孵育5 min，逐滴加入细胞培养液中，48～72 h后收取细胞进行后续实验。

1.6 细胞存活实验

将各组别细胞分别接种于96孔板，10 000/孔，细胞贴壁伸展后，将培养基更换为含不同浓度吉西他滨的完全培养基，各组各浓度分别设置3个重复孔，药物处理48 h后将培养基更换为含10%CCK8的完全培养基，37℃温箱孵育1～2 h，酶标仪测定D450nm值，以未加药孔作为对照，计算细胞存活率。

1.7 克隆形成

将对照及miR-451a转染组细胞接种于6孔板，加入吉西他滨（CFPAC-1 1 μmol/L；PANC-1 5 μmol/L）处理24 h后消化，重悬计数后接种于新的6孔板中，1500/孔，10～14 d后镜下观察克隆形成情况，多数克隆含有50个细胞以上时终止培养，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染液染色20 min，自来水冲洗后自然风干，扫描图像后用Image J统计克隆个数。

1.8 流式凋亡检测

将对照及miR-451a转染组细胞接种于6孔板，加入吉西他滨后处理48 h，用不含EDTA的胰酶消化、收集细胞，用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒进行染色，上机检测凋亡情况。

1.9 裸鼠成瘤实验

将1×107PANC-1细胞接种于裸鼠右侧腋窝皮下，10 d后形成肉眼可见的肿瘤后开始给药，对照组仅给予吉西他滨，miR-451a治疗组同时给予miR-451a agomir和吉西他滨。吉西他滨50mg/kg腹腔注射，每周2次；miR-451a agomir 10 nmol瘤内注射，每周2次。3周后处死小鼠，解剖肿瘤，量取肿瘤体积。本实验经生物工程研究所实验动物管理和使用委员会批准。

1.10 统计分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析；连续变量用x±s表示，组间比较使用t检验；细胞存活曲线采用重复测量方差分析比较；生存资料采用Kaplan-Miere法绘制生存曲线，用Log-Rank检验分析差异。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌耐药细胞株中miR-451a水平明显下调

亲本细胞株CFPAC-1和耐药细胞株CFPAC-1 GemR在不同浓度吉西他滨作用下的细胞存活率如图1A所示，CFPAC-1 GemR存活率高于其亲本细胞株，说明耐药细胞株对吉西他滨的敏感性明显降低。将CFPAC-1和CFPAC-1 GemR进行miRNA测序，选取其中变化较明显的miRNA用RT-PCR验证，结果见图1B，miR-451a在耐药细胞株中的表达水平明显下调。

图1 耐药细胞株鉴定及差异miRNA表达验证

2.2 miR-451a过表达增加胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性

对照组和miR-451a过表达组用梯度浓度的吉西他滨处理，48 h后利用CCK8测定细胞存活情况，并绘制存活曲线。结果表明，在CFPAC-1（图 2A）和 PANC-1（图 2B）细胞中，转染 miR-451a mimics后细胞存活率下降，说明miR-451a负向调控胰腺癌细胞吉西他滨耐药。

图2 miR-451a过表达影响胰腺癌细胞吉西他滨耐药

2.3 miR-451a增强吉西他滨抑制胰腺癌细胞增殖的作用

对照组细胞和miR-451a过表达组细胞用同样浓度的吉西他滨处理24 h后，接种于6孔板行克隆形成实验，结果显示，在CFPAC-1（图3A）和PANC-1（图3B）细胞中，转染miR-451a mimics后克隆形成明显少于对照组，表明miR-451a过表达使吉西他滨抑制细胞增殖的作用增强。

2.4 miR-451a增强吉西他滨诱导细胞凋亡的作用

吉西他滨处理48 h后流式细胞检测对照组和miR-451a过表达组的细胞凋亡情况，结果如图4，miR-451a过表达组细胞凋亡比例高于对照，差异具有统计学意义。该结果提示，miR-451a对吉西他滨诱导的细胞凋亡有促进作用。

图3 miR-451a过表达使吉西他滨抑制细胞增殖作用增强

图4 miR-451a增强吉西他滨诱导细胞凋亡的作用

2.5 miR-451a诱导裸鼠体内肿瘤对吉西他滨敏感

基于体外实验结果，我们进一步在裸鼠体内验证了miR-451a对胰腺癌耐药的调控作用。将PANC-1细胞注射裸鼠皮下成瘤后，给予吉西他滨治疗，结果如图5，miR-451a agomir给药组的肿瘤体积明显小于对照组，说明miR-451a增加了裸鼠体内肿瘤对吉西他滨的敏感性。

图5 miR-451a诱导裸鼠体内肿瘤对吉西他滨敏感

2.6 miR-451a表达水平与胰腺癌患者预后相关

从以上结果可以看出，miR-451a在胰腺癌细胞和裸鼠肿瘤中与胰腺癌吉西他滨耐药相关，我们进一步探究了miR-451a与胰腺癌病人预后的关系。利用在线工具Oncolnc调取肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库中胰腺癌病人的生存资料和miR-451a表达水平，并进行Kaplan-Miere生存分析，结果表明，miR-451a表达水平较低的胰腺癌患者预后更差（图6）。

图6 miR-451a表达水平与胰腺癌患者预后的关系

3 讨论

胰腺癌恶性程度高、诊断治疗困难、预后极差。2018年全球癌症统计数据显示，胰腺癌新发与死亡病例分别为458 918例和432 242例，是为数不多的死亡例数接近新发例数的癌症之一[12]。目前治疗手段的匮乏是预后差的主要原因。吉西他滨是少数对胰腺癌治疗效果较好的化疗药物之一，但仍然存在显著的耐药问题，寻找新的治疗靶标克服耐药至关重要[2]。

miRNA作为具有多样性和高度保守性的调节因子，在肿瘤耐药中发挥重要的调控作用[4]。研究发现miRNA可以通过不同的通路调控胰腺癌对吉西他滨耐药，如miR-34、miR-1246等可以通过肿瘤干细胞通路调节胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性[13-14]，miR-125b、miR-365 等则是通过凋亡通路调控胰腺癌吉西他滨耐药[15-16]。本研究中我们构建了胰腺癌耐药细胞系作为吉西他滨耐药的模型，对其进行了miRNA测序，并对测序结果中部分miRNA进行了表达水平验证，发现miR-451a、miR-122-5p、miR-129-5p等多个 miRNA在耐药细胞系中表达下调，miR-1-3p、miR-206等多个miRNA在耐药细胞系中表达上调。其中，miR-129-5p、miR-206有相关文献报道与吉西他滨耐药相关，且变化趋势与本研究一致[17-18]。

miR-451a位于染色体17q11.2，在多种肿瘤中表达异常[19]。多项研究表明miR-451a与肿瘤的发生发展相关，在肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、胶质瘤及白血病中均有报道，与多种肿瘤的复发、转移和预后也有关系[20-22]。miR-451a与耐药的相关性也有相关研究，在FLT3-ITD阳性的急性髓细胞白血病中，miR-451a可以逆转细胞对化疗药物的耐药[23]；Liu等报道miR-451a过表达可以增加乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性[24]。在胰腺癌吉西他滨耐药中miR-451a的功能尚无相关研究。我们发现在吉西他滨耐药细胞株中miR-451a水平下调明显，接下来探究了miR-451a在胰腺癌吉西他滨耐药中的调控作用，发现在体外和裸鼠体内，miR-451a可以促进胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。

miRNA主要通过与靶基因mRNA的3'非翻译区（UTR）序列发挥转录后调控作用，通常一条miRNA可以调控多个基因。已证实的miR-451a靶基因有 ABCB1、AKT1、c-MYC、BCl-2等[25-27]，其中许多基因都与多药耐药相关。因此，我们推测miR-451a可能通过这些基因调控胰腺癌细胞对吉西他滨耐药，但须进行后续的筛选和验证。

同时，我们对TCGA数据库中胰腺癌患者生存资料进行了分析，发现miR-451a低表达与胰腺癌患者不良预后相关。由于数据库临床资料并没有收集患者复发情况及化疗史，所以并不能对miR-451a和吉西他滨耐药的关系做具体分析，但从这个结果中可以推断，miR-451a可能与胰腺癌的进展相关。

综上，我们筛选了与吉西他滨耐药相关的miRNA，并通过体外和动物实验验证了miR-451a在胰腺癌吉西他滨耐药中的调控作用，有助于进一步解析胰腺癌吉西他滨耐药产生的机制，为克服胰腺癌耐药提供新的思路。