加味小柴胡汤有效成分抑制幽门螺杆菌的效果

肖湘滇 杨应合 李桂香

幽门螺杆菌属于革兰氏阴性杆菌，呈螺旋形，于1983年被首次从慢性活动性胃炎的胃黏膜活检组织中成功分离出，幽门螺杆菌感染后可导致消化道溃疡、胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤等疾病，不良预后可导致进一步演变为胃癌，因此需要有效的药物进行抑制；而加味小柴胡汤出自《医宗金鉴》卷四十九，基本方由加味干姜、茯苓、白术、黄连组成[1]，是临床上治疗胃溃疡疾病的常用方，获得了较好的临床治疗效果，既往文献已证实黄铜物质部位、皂苷物质部位、挥发油物质部位、酚酸物质的提取部位均可有效抑制幽门螺杆菌，但尚未明确发挥抑制作用的具体成分[1]，因此在本次研究中，旨在研究探讨加味小柴胡汤有效成分抑制幽门螺杆菌的临床效果，具体情况如下。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

试剂：盐酸小檗碱（批号PS011-0100MG，10 mg）、柴胡皂苷（批号 PS0-0410-0025，10 mg）、6-姜酚（批号 PS0663-0200，10 mg）、黄芩苷试剂（批号PU0032-0025，10 mg），均由成都普思生物科技股份有限公司；克拉霉素胶囊（由江苏亚邦爱普森药业有限公司生产，国药准字H20050292，10 mg）。

仪器：数显电热培养箱；-80℃立式超低温保存箱；光学显微镜；超纯水机；游标卡尺；立式灭菌器；洁净工作台。

材料：哥伦比亚培养基；2.5 L圆底立式厌氧培养袋；无菌脱纤维绵羊血；微需氧产气袋；HB四连式牛津杯；哥伦比亚血琼脂基础。

质控菌：幽门螺杆菌标准菌种，由上海北诺生物科技有限公司提供。

1.2 试验药液以及选择性培养基的配制

哥伦比亚血琼脂固体培养基：精确称取39.0 g哥伦比亚血琼脂固体培养基，并加热溶于1 000 mL的双蒸水中，待培养基被完全溶解之后采用121℃高压灭菌15 min，然后待其自然冷却到50℃左右，然后快速将浓度为5%的无菌脱纤维绵羊血，将其充分混匀，并趁热将其置入无菌培养皿中，等待培养基的自然冷凝以备用[2]。

哥伦比亚液体培养基：精确称取29.0 g哥伦比亚血琼脂液体培养基，并加热溶于1 000 mL的双蒸水中，待培养基被完全溶解之后采用121℃高压灭菌15 min以备用。

阳性对照液配制：精确称取0.25 g克拉霉素胶囊内容物，并将其加入至含有100μL吐温-80的双蒸水中，然后定容到10 mL，并使用超声对其进行15 min的震荡，从而配制成浓度为0.025 g/mL的药液以备用。

有效成分溶液配制：精确称取10 mg盐酸小檗碱、柴胡皂苷α、6-姜酚、黄芩苷的油膏或者是粉末，并将其加入至含有100μL吐温-80的双蒸水中，然后定容到10 mL，并使用超声对其进行15 min的震荡，从而配制成浓度为1.00 mg/mL的药液以备用[3]。

1.3 复苏、培养菌种

从-80℃中取出幽门螺杆菌标准菌株，在室温下放置，精确取200μL标准菌种指固体培养基上，同时采用L型玻璃棒对菌种进行平铺，并将其装入培养袋中，然后将微需氧产气袋放入培养袋中，并迅速将其密封再将培养袋放入恒温为37℃的培养箱中，进行72 h的培养；完成培养后，鉴定菌种，确认为幽门螺杆菌后，将培养基上的菌苔刮除，然后将菌苔移至50 mL的液体培养基中，作为原菌液[4]。

1.4 制备菌液以及确定菌液浓度

取原菌液使用无菌水稀释成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的菌悬液，并将其充分摇匀，然后取1 mL的菌悬液放入到培养皿中，并将其倒入至已融化且冷却到45～50℃的细菌培养基中，将平板轻轻旋动，促使培养基与菌液充分混匀，待冷凝之后将其倒置，再将其放入培养袋中[5]，然后将微需氧产气袋放入袋中；并迅速将其密封再将培养袋放入恒温为37℃的培养箱中，进行72 h的培养；对每个浓度进行三次的平行试验；同时使用菌落计数的方法，对稀释后的菌液浓度进行确定，然后选择合适的菌液浓度展开体外抗菌试验[6]。

1.5 采用液体稀释法对最低抑菌浓度进行测定

采用梯度稀释法进行液体稀释试验，并计算最小抑菌浓度。取阳性照组药液、盐酸小檗碱、柴胡皂苷、6-姜酚、黄芩苷药液各1 mg/mL浓度，使用液体培养基将其稀释为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128；并将各组稀释后的药液各取1 mL，将其放置于2 mL的试管中，并在将50 μL的菌悬液加入至各管中，每个稀释级别的操作均进行3次；同时制作一个2 mL的液体培养对照管以及一个2 mL的菌悬液对照管，并进行72 h的培养[7]。

1.6 采用琼脂扩散法对抑菌环直径进行测定

取6个900 mm培养皿，注入哥伦比亚血琼脂15 mL，冷凝后作为底层；另外选取适量的热融琼脂培养基，并加入适量的菌悬液，将其充分摇匀后放入至5 mL的培养皿；待冷凝后，将HB四连式牛津杯放在培养皿上，每个孔加入100μL部位药液，并进行72 h的培养，对每个有效成分重复进行三次；阴性对照选择无菌水[8]。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对本次研究中的数据进行分析处理，计数资料组间比较采用χ2检验，计量资料采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 加味小柴胡汤有效成分的抑菌圈直径分析

采用牛津杯方法进行琼脂扩散实验，测定抑菌圈直径。分别对5组试验进行测量，每组5例，共计25例试验。实验中所有药物浓度相同。测量结果显示与阴性对照组相比，阳性对照组、各给药组的抑菌圈直径显著增大；20例给药组的抑菌圈直径明显大于阳性对照组；而盐酸小檗碱的抑菌圈直径明显大于其余15例药组，差异均具有统计学意义（P＜0.05），具体数据分析见表1。

表1 加味小柴胡汤有效成分的抑菌圈直径分析（±s）

表1 加味小柴胡汤有效成分的抑菌圈直径分析（±s）

注：与阴性对照组相比，▲ P＜0.05；与阳性对照组相比，◆ P＜0.05；与盐酸小檗碱相比，b P＜0.05。

分组 抑菌圈直径（mm） 药物浓度阴性对照组 0 -阳性对照组（n=5） 7.15±1.05▲ 0.025 mg/mL盐酸小檗碱（n=5） 15.91±0.78▲◆ 1.00 mg/mL柴胡皂苷（n=5） 13.18±0.32▲◆b 1.00 mg/mL 6-姜酚（n=5） 13.24±0.19▲◆b 1.00 mg/mL黄芩苷（n=5） 12.17±0.58▲◆b 1.00 mg/mL

2.2 加味小柴胡汤有效成分的最低抑菌浓度分析

本次研究显示，盐酸小檗碱药液的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）指标明显低于其余三个给药组，1：4、1：8、1：32、1：64、1：128稀释比例的盐酸小檗碱、柴胡皂苷、6-姜酚、黄芩苷药液均呈浑浊状态，而1：2、1：4、1：8稀释的盐酸小檗碱呈澄清状态，柴胡皂苷、6-姜酚、黄芩苷药液均仅在1：2、1：4比例稀释下呈澄清状态。差异均具有统计学意义（P＜0.05），具体数据分析见表2。

3 讨论

目前临床上治疗幽门螺杆菌感染患者主要采用两种抗菌药物和质子泵抑制药组合的三联疗法，获得了较好的治疗效果，但是由于耐药性的产生，此种治疗方式的疗效逐渐减低，有着较高的复发率；因此近年来，多数临床学者将目光转移至中药治疗幽门螺杆菌感染病患，据相关研究证实黄连解毒汤、四君子汤、半夏泻心汤以及小柴胡汤等中药汤剂治疗幽门螺杆菌感染病患均取得了较好的临床治疗效果；且经中医临床实践表明，由幽门螺杆菌感染所导致的慢性胃炎、胃溃疡病患，多见湿热证，其次多见肝胃不和证[9]；而加味小柴胡汤是将柴胡作为君药，起到了疏肝升阳、和解表里之功效，并配以黄芩、黄连可起到清热解毒之功效，而茯苓、生姜、半夏、白术具有补脾补气、解表散寒、燥湿化痰之功效；而大枣、人参则起到增强补脾益气功效的作用，加入甘草对方中的诸药进行调和；因此采用加味小柴胡汤治疗由幽门螺杆菌感染所导致的慢性胃炎、胃溃疡患者与中医辩证的普遍规律相符合[10]；

表2 加味小柴胡汤有效成分的最低抑菌浓度分析

在本次研究中，主要是对加味小柴胡汤中的有效成分抑制幽门螺杆菌的效果进行了研究，结果显示，四个提取部位的有效成分对幽门螺杆菌均起到了显著的抑制作用，与既往研究报道一致[11]；且本次研究结果显示，盐酸小檗碱的最低抑菌浓度、抑菌圈直径明显优于其余三个有效成分；本次实验结果为研究加味小柴胡汤抑制幽门螺杆菌提供了科学的依据。

此外本次研究中的实验也存在着一定的局限性，研究人员发现柴胡皂苷和6-姜酚在双蒸水中的溶解性较差，因此针对水溶性较差的物质成分，医院在实验人员在进行溶解时加入了1%吐温-80以起到协助溶解的效果，并且据相关文献报告，只有浓度在70%以上的吐温-80才能起到抑菌的效果[12]，因此本次实验中，浓度为1%的吐温-80不会产生抑菌影响。医院在选择阳性对照药液时，主要是考虑到克拉霉素的临床治疗效果较好，且不良反应率较低；另外需要注意的是，对最低抑菌浓度的浑浊情况及抑菌圈直径进行观察时，可将白光作为观察背景，有利于更加清晰、准确地观察实验结果。

综上所述，加味小柴胡汤中的盐酸小檗碱、柴胡皂苷、6-姜酚、黄芩苷等有效成分对幽门螺杆菌均有着一定的抑制作用。