柴胡中柴胡皂苷c、a、d 含量测定方法的建立

卢丽香，周世友，曾海生，赵凤仙，杨桂林，谭雨坪

（1.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；2.广西中医药大学，南宁 530200）

柴胡始载于《神农本草经》，列为上品，别名茈胡、地薰。中国药典规定柴胡（Bupleurum ChinenseDC.）或狭叶柴胡（B.scorzonerifoliumWilld.）为正品，供药用，二者一般习称为“北柴胡”及“南柴胡”［1］。药用部分为柴胡的根或全草，具有解表和里、疏肝解郁、升提中气之功效。主治感冒发热、寒热往来、黄疸肝炎及月经不调等［2］。

柴胡主要有效成分为柴胡皂苷、挥发油、黄酮、脂肪酸等成分［3］。目前已经从柴胡不同部位分离到柴胡皂苷（saikosaponins）a～d 等［4］。研究表明，柴胡皂苷具有解热、镇静、抗炎、免疫调节、抗病毒、抗肝纤维化、抗肿瘤等药理活性［5］，柴胡皂苷a、d为其主要活性成分，并且柴胡皂苷 d 的药理活性最强［6，7］。本研究采用高效液相色谱法，以蒸发光散射检测器进行检测，对柴胡药材中柴胡皂苷c、a、d 进行了含量测定，以建立测定柴胡根3 种皂苷含量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters公司，包含2489UV、四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱和Empower3 液相工作站）；Alltech ELSD 2000ES 型蒸发光检测器、纯水仪（法国Millipore 公司）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；TGL-16G 型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ5200V 型超声清洁器（昆山市超声仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）。

1.1.2 药物与试剂 柴胡皂苷c（批号：20191015）、柴胡皂苷a（批号：20190812）、柴胡皂苷d 对照品（批号：20190914），纯度＞98%，均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司，氨水（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），甲醇、乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），水为去离子水。

柴胡为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC）或“狭叶”柴胡（B.scorzonerifoliumWi11d）的干燥根茎（购自广东康美药业有限公司，批号20190418）。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水，梯度洗脱（表1），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测器为蒸发光散射检测器（ELSD），进样量为10 μL。

表1 HPLC 梯度洗脱条件

1.2.2 样品溶液的制备 精密称取柴胡药材粉末（过2 目筛）1.0 g，置于150 mL 具塞锥形瓶中，加入体积比为10%的氨水-甲醇溶液25 mL，超声提取45 min，过滤，用甲醇洗涤锥形瓶，在通风橱中62 ℃水浴挥干，残渣加甲醇溶解，定容于5 mL 容量瓶中。

1.2.3 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷c、a、d 对照品9.52、10.14、15.28 mg，加甲醇适量使溶解，并定容至10 mL容量瓶中，得到含柴胡皂苷c、a、d分别为0.952、1.014、1.528 mg/mL 的混合对照品溶液。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

2.1.1 线性关系考察 精密吸取柴胡皂苷混合对照品溶液 2、5、8、10、12、15、20 μL 分别注入高效液相色谱仪，测定相应条件下的峰面积。以峰面积为纵坐标，以进样量（μg）为横坐标，制得标准曲线并计算相对应的回归方程。精密吸取上述柴胡皂苷混合对照品稀释液进样，测定其信号（以峰高计算）与噪声比值，将S/N=3 时的浓度定为检测限（LOD），将S/N=10 时的浓度定为定量限（LOQ）。各组分在各自的含量范围内线性关系良好，结果如表2 所示。

表2 线性方程及线性范围

2.1.2 精密度试验 精密称取中药柴胡粉末1.0 g，按“1.2.1”项下的色谱条件以及流动相条件进样，连续进行6 次，并计算柴胡皂苷a 面积的RSD（%）、柴胡皂苷c面积的RSD（%）、柴胡皂苷d面积的RSD（%）。结果表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d 的RSD分别为 1.27%、1.05% 和 0.58%，RSD均小于3.0%，表明所用液相色谱仪的精密度较好。

2.1.3 稳定性试验 分别于在 0、2、4、8、12、24 h 按“1.2.1”项下的色谱条件以及流动相条件进样，测定各供试品的峰面积。结果表明，柴胡中的柴胡皂苷a 峰面积的RSD为1.23%、柴胡皂苷c 峰面积的RSD为0.85%、柴胡皂苷d 峰面积的RSD为1.62%，均小于3.0%，说明供试品在24 h 内保持良好的稳定性。

2.1.4 重复性试验 精密称取6 份柴胡药材粉末（过2 目筛）1.0 g，测定柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d 的平均含量。结果表明，柴胡中柴胡皂苷c、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的平均含量分别为0.954、0.982、1.826 mg/g；柴胡中柴胡皂苷 a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 含量的RSD分别为2.08%、2.42%、1.54%，均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 加样回收率试验 精密称取9 份柴胡药材粉末0.5 g，分成低、中、高加样组（0.5 g 药材含量的80%、100%、120%加样），每组分别加入混合对照品溶液（柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d），计算柴胡低、中、高加样组中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 的平均回收率及其RSD。从表3 可以看出，该方法准确性良好。

表3 柴胡加样回收率试验结果（n=9）

2.1.6 专属性试验 精密吸取甲醇溶剂10 μL，注入液相色谱仪，按上述方法进行测定，在测定时间内没有色谱峰出现，说明甲醇溶剂不影响柴胡皂苷的测定，方法的专属性良好，甲醇溶剂的色谱见图1。

图1 甲醇HPLC 色谱

精密吸取混合对照溶液1 mL，置于5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，分别精密吸取5和10 μL。结果表明，柴胡皂苷c、a、d 的保留时间分别为7.4、17.8、29.1 min（图 2）。

图2 柴胡皂苷混合对照品HPLC 色谱

2.2 柴胡样品含量测定

精密称定3 份柴胡药材粉末1.0 g 过2 目筛，按“1.2.1”项下的色谱条件以及流动相条件进样，通过外标一点法计算柴胡皂苷c、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的含量，结果见表4。

表4 柴胡样品含量测定结果

3 小结

本研究建立的高效液相色谱法测定柴胡中柴胡皂苷c、a、d 的含量操作简便、准确度高、精密度好，3种柴胡皂苷的色谱峰和试样中其他组分的色谱峰可达基线分离，且分离度、峰型较好，可以作为柴胡皂苷c、a、d 的含量测定方法。