HPLC法测定猪血浆中帕托珠利的方法学建立

沈佳晨，霍浩远，全家兴，李小龙，卜仕金

（扬州大学兽医学院／江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225000）

帕托珠利（Ponazuril），又名妥曲珠利砜（Toltrazuril sulfone），化学名为1-甲基-3-［3-甲基-4-（4-三氟甲基砜基-1-苯氧基）-苯基］-［1，3，5］-三嗪-［2，4，6］-三酮，分子式C18H14F3N3O6S。帕托珠利属三嗪酮类药物，主要用于治疗原虫疾病，该药最早由德国Bayer 公司开发，并于2001年经FDA 批准在美国上市。帕托珠利对球虫的各个发育阶段都有效果，具有用药量低，安全性高，无耐药性等特点［1］，凭借其强大的抗原虫效果以及相对低廉的价格，在其上市后就迅速占领美国市场［2］。目前测定帕托珠利的方法主要有HPLC［2-4］法和LC-MS［5-7］法两种，研究采用的是HPLC 法，旨在建立一种可以在猪血浆中准确快速测定帕托珠利含量方法，以期为研究帕托珠利在猪体内的代谢动力学提供基础。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂 高效液相色谱仪：Agilent 1260，安捷伦公司；电子分析天平：感量0．0001 g，德国赛多丽丝天平公司；超声仪：KS-250D，宁波科生仪器厂；超纯水设备：UPH-11-20T，成都超纯科技有限公司；氮吹仪：Organomation Associates 公司；台式高速离心机：Centrifuge 5810 R，Eppendorf 公司；微量移液器：10、200、1000 μL，Eppendorf 公司。

帕托珠利对照品（含量99．6%，批号：180502WS）购自湖北龙翔药业科技股份有限公司；甲醇，色谱纯，购自美国TEDIA 公司；乙腈，色谱纯，购自美国TEDIA 公司；乙酸，色谱纯，购自德国CNW 公司；乙酸乙酯，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1．2 方法

1．2．1 提取方法 准确吸取200 μL 血浆于2 mL 离心管中，加入1 mL 乙酸乙酯涡旋3 min，12000 r／min离心10 min，将上清液移至10 mL 离心管中，下层残渣用0．5 mL 乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液并于氮气下吹干。氮吹后的残渣用200 μL 流动相复溶，12000 r／min 离心10 min，取上清经0．22 μm有机滤膜过滤，滤液供HPLC 分析。

1．2．2 色谱条件 色谱柱：安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0．2%乙酸水溶液（53 ∶47，V／V）；流速1 mL／min；紫外检测波长250 nm；柱温35 ℃；进样量：20 μL。

1．2．3 试液的配制 标准储备液与质控储备液：准确称取约10 mg 帕托珠利标准品于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容并稀释至刻度，浓度为1 mg／mL，于-20 ℃保存。质控储备液于做稳定性试验当日配。工作液：准确吸取适量帕托珠利标准储备液，用流动相稀释成一定浓度的系列浓度的标准工作液，现配现用。

1．3 方法学验证

1．3．1 准确度与精密度的测定 按照生物样品定量分析指导原则，用质控储备液配制定量限、低、中、高四个血浆浓度添加水平，即0．1、0．2、5、7．5 μg／mL四个血浆添加浓度。以1．2．1 项的前处理方法进行处理后，按照1．2．2 项的条件进行检测。每批每个浓度制备5 个平行，连续3 d。测定结果带入当天绘制的标曲中，计算回收率以及变异系数。

1．3．2 稳定性考察 按照生物样品定量分析指导原则，采用低和高浓度质控样品进行稳定性的考察。

1．3．2．1 储备液在冻存条件下的稳定性 用质控储备液配制浓度为0．2、7．5 μg／mL 的帕托珠利标准工作液，每个浓度15 个平行，并分别于0、30、60 d上机分析。通过与第0 天数据比较，考察储备液冻存期间（-20 ℃）的稳定性。

1．3．2．2 血浆样品在冻存条件下的稳定性 用质控储备液配制浓度为0．2、7．5 μg／mL 的帕托珠利血浆添样品，每个浓度15 个平行，并于-20 ℃条件下冻存。分别在0、30、60 d 对样品进行分析。通过与第0 天数据比较，考察血浆样品冻存期间（-20 ℃）的稳定性。

1．3．2．3 血浆样品反复冻融的稳定性 用质控储备液配制浓度为0．2、7．5 μg／mL 的帕托珠利血浆添样品，每个浓度10 个平行。每个浓度的5 个平行立刻处理分析，得到0 时数据。其余样品在-20 ℃冻存1 d 后取出解冻，之后再次冷冻、解冻，反复3次循环处理，两次冻融时间间隔至少为5 h。通过与0 时数据比较，考察血样反复冻融的稳定性。

1．3．2．4 血浆样品在室温放置的稳定性 用质控储备液配制浓度为0．2、7．5 μg／mL 的帕托珠利血浆添样品，每个浓度5 个平行，并立刻处理分析，得到0 时数据，之后在室温（约20 ℃）6 h 后进行样品分析。通过与0 时数据比较，考察血样室温放置的稳定性。

2 结果与分析

2．1 色谱行为 由帕托珠利标准品、空白血浆、空白添加样品的分离图谱可知，空白血浆与杂质对帕托珠利出峰无明显干扰，帕托珠利出峰良好，保留时间在9 min 左右（图1）。

图1 HPLC 色谱图（A、B、C 分别为空白血浆、0．1μg／mL 帕托珠利标准品、空白血浆添加0．1μg／mL 帕托珠利标准品）Fig 1 HPLC chromatograms（A，B，and C are respectively blank plasma，ponazuril standard at 0．1μg／mL and spiked pig plasma at the level of 0．1μg／mL）

2．2 标准曲线和线性范围 由表1所示帕托珠利在0．10～10．00 μg／mL 浓度范围内，标准工作液中帕托珠利与峰面积呈良好的线性关系（r≥0．999）（表1）。以标准工作液药物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制的标准曲线见图2。

表1 帕托珠利标准回归方程及相关系数Tab 1 Linear regression equation and correlation coefficient of ponazuril

图2 帕托珠利标准曲线图Fig 2 Standard working cure of ponazuril

2．3 检测限和定量限 帕托珠利在猪血浆中的最低检测限为0．04 μg／mL，最低定量限为0．1 μg／mL。

2．4 准确度和精密度 猪血浆中帕托珠利测定方法准确度和精密度的测定结果见表2。由表2可见，猪血浆样品在0．1～10 μg／mL 时，批内和批间回收率均大于90%，批内和批间变异系数均小于9%，该方法符合生物样定量分析指导原则的要求且重复性良好。

2．5 稳定性 帕托珠利储备液稳定和血浆样品稳定性的考察结果分别见表3和表4。结果显示，储备液冻存稳定（RSD＜4%），血浆样品冻存稳定（RSD＜8%），血浆样品反复冻融后稳定（RSD＜6%），血浆样品室温放置稳定（RSD＜4%），表明帕托珠利在整个实验中过程中基本没有降解。

表2 血浆样品中帕托珠利的相对回收率和精密度Tab 2 The recovery of ponazuril and the precision determination in plasma

表3 帕托珠利储备液在-20 ℃储存条件下的稳定性Tab 3 The stability of ponazuril stock solutions stored at -20 ℃

表4 帕托珠利血浆样品的稳定性Tab 4 The stability of ponazuril in plasma

3 讨论与结论

3．1 色谱条件的优化 根据文献报道，本实验分别尝试了以甲醇-水、甲醇-0．2%乙酸水、乙腈-水、乙腈-0．2%乙酸水作为流动相。结果显示，以甲醇-水和甲醇-0．2%乙酸水系统作为流动相时，分离效果不理想，药物洗脱时间过长；而以乙腈-水体系作为流动相时，主峰会出现拖尾现象，因此，选择乙腈-0．2%乙酸水作为流动相。在本研究中发现，适当提高乙腈在流动相中的比例，可极大程度缩短帕托珠利的保留时间，当乙腈在流动相中的比例达到57%时，主峰可与杂峰完全分离。在柱温低于35 ℃时，低浓度样品主峰峰形较差，由于柱温过高会减少色谱柱的使用寿命，故选择柱温35 ℃，在此条件下，帕托珠利的出峰时间在9 min 左右。由于在猪血浆样品中20 min 左右会出现干扰杂峰，为了不影响下一个样品的检测，选择13 min 作为一个样品的分析周期。

3．2 提取条件的优化 据文献报道，帕托珠利样品的提取剂选择主要有乙酸乙酯［3］、乙腈［8-10］、甲醇［1］等，本试验分别对这3 种提取剂进行了考察，结果发现，3 种提取剂的提取回收率均可达到90%左右，但乙腈和甲醇属于蛋白沉淀剂，提取后所含杂质较多，影响低浓度样品测定的准确性。而乙酸乙酯的提取属于液液萃取，相比于蛋白沉淀，提取后杂质明显减少，同时乙酸乙酯的挥发性强于其他提取剂，可明显缩短氮吹时间，提高工作效率。

研究所建立的猪血浆测定帕托珠利的方法操作简单，灵敏度高，血浆中帕托珠利的线性范围为0．1～10 μg／mL，样品回收率高，平均回收率大于90%，能够准确测定各个时间点的血浆药物浓度。在方法学论证和稳定性考察中，准确度、精密度和各个阶段的稳定性均符合生物样定量分析指导原则的要求，能够保证检测结果的准确性和重现性。