高效液相色谱法测定清肺止咳散中黄芩苷含量

朱育红，朱 弘

（陕西省兽药监测所，西安710016）

清肺止咳散收载于《中华人民共和国兽药典》2015年版二部，是由桑白皮、知母、苦杏仁、前胡、金银花、连翘、桔梗、甘草、橘红、黄芩十味药材经粉碎、混合而制成的中药散剂，具有清泻肺热，化痰止痛的功能，主治肺热咳嗽，咽喉肿痛。现广泛应用于畜禽咳喘病的治疗，但质量标准无含量测定方法。为了更好地控制其质量，参考文献方法，研究建立了采用反相高效液相法测定清肺止咳散中黄芩苷的含量测定方法。

1 仪器与材料

1．1 仪器 PerkinElmer 液相色谱仪，Waters 液相色谱仪，UV 检测器，WatersC18 柱、 安捷伦C18 柱、PerkinElmer C18 柱；Sartorius Cp225D 分析天平。

1．2 试药与试剂 黄芩苷对照品分别来源于中国食品药品检定研究院（批号为110715-201720，标示含量为93．5%）和中国兽医药品监察所（批号为Z0271109，Z0271705 标示含量分别为98．8%、96．8%）。

清肺止咳散样品，共10 批，其中实验室自制小样1 批（样品编号1）；哈尔滨摩天农科兽药有限公司3 批，批号分别20180514、20180515、20180516（样品编号2-4）；河北远征禾木药业有限公司3批，批号分别3GN180201、3GN180202、3GN180203（样品编号5-7）；河南环通制药有限公司3 批，批号分别20160308、20180311、20180524（样品编号8-10）。

清肺止咳散缺黄芩的阴性样品，按处方及制法制成缺黄芩的阴性样。制备小样、缺黄芩的阴性样的药材均购自西安怡康大药房。

甲醇Fisher Chemical（国药集团化学试剂有限公司提供，色谱纯，批号：178337 等）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 参照《中华人民共和国兽药典》2015年版二部“清解合剂”中黄芩含量测定方法。流动相：甲醇-0．3%磷酸溶液（55 ∶45）；流速：1．0 mL／min；检测波长276 nm；柱温：30 ℃；进样量：5～10 μL［1］。

2．2 溶液的制备

2．2．1 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇少许超声使溶解，加50%甲醇稀释，摇匀，制得黄芩苷对照品溶液（每1 mL 含黄芩苷0．1 mg）［2］。

2．2．2 供试品溶液的制备 取实验室自制清肺止咳散小样1．0 g，精密称定，置100 mL 量瓶中，加甲醇10 mL，超声处理30 min，放至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得［2］。

2．2．3 阴性对照溶液的制备 取缺黄芩阴性样1．0 g，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液［2］。

2．2．4 小样测试结果 按照2．1 色谱条件，采用外标法，以峰面积计算，实验室自制小样每1g 含黄芩苷13．07 mg，13．13 mg，平均值为13．1 mg。

2．3 系统适用性和专属性试验 精密量取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10、5 μL，注入液相色谱仪，按2．1 项色谱条件测定，结果理论塔板数以黄芩苷峰计算为6374（图1-1）、7865（图1-2）；供试品色谱图中黄芩苷峰与临峰分离良好，与前峰分离度为7．0（图2-1），与后峰分离度为2．0（图2-2）；阴性对照色谱在与对照品色谱相同保留时间处无干扰峰（图3-1，3-2）。结果表明，系统适用性可以满足检测要求；处方中其他成分对黄芩定量检测无干扰，专属性也能满足检测要求［1］。

图1-1 黄芩苷对照品色谱图（进样量10 μL，Waters C18 柱，理论塔板数6374）Fig 1-1 Chromatogram of the Baicalin reference substance（Injection volume，10 μL，Column：Waters C18，Theoretical plate number：6374）

图1-2 黄芩苷对照品色谱图（进样量5 μL，PE C18 柱，理论塔板数7865）Fig 1-2 Chromatogram of the Baicalin reference substance（Injection volume，5 μL，Column：PE C18，Theoretical plate number：7856）

图2-1 供试品色谱图（进样量10μL，Waters C18 柱）Fig 2-1 chromatogram of the test sample（Injection volume，10 μL，Column：Waters C18）

图2-2 供试品色谱图（进样量5 μL，PE C18 柱）Fig 2-2 chromatogram of the test sample（Injection volume，5 μL，Column：PE C18）

2．4 线性关系考察 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇少许超声使溶解，加50%甲醇稀释，制成每1 mL 含黄芩苷0．379 mg 的对照品贮备液。取贮备液，分别精密吸取1、2、5 mL，置100 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，制成①、②、③号溶液，浓度分别为3．8、7．6、19．0 μg／mL，再分别精密吸取黄芩苷对照品贮备液5、10、20 mL，置50 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，制成④、⑤、⑥号溶液，浓度分别为38、76、152 g／mL，以黄芩苷对照品贮备液作为⑦号溶液，浓度0．379 mg／mL，按上述色谱条件，分别进样5 μL，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），以进样浓度为横坐标（X），进行线性回归，得回归方程y＝16412x-25735，R2＝0．9998（n＝7），黄芩苷在3．8～379 μg／mL 范围内线性关系良好（见图4、图5）。

图3-1 缺黄芩苷的阴性样品色谱图（ 进样量10 μL，Waters C18 柱）Fig 3-1 Negative chromatogram of baicalin（Injection volume，10 μL，Column：Waters C18）

图3-2 缺黄芩苷的阴性样品色谱图 进样量5 μL，PE C18 柱Fig 3-2 Negative chromatogram of baicalin（Injection volume，5 μL，Column：PE C18）

图4 黄芩苷线性试验色谱峰综合图Fig 4 Baicalin linear test chromatogram

2．5 准确度 采用加样回收的方法［1］

2．5．1 黄芩苷对照品母液制备 取黄芩苷对照品（Z0271705，标示含量96．8%）57．5 mg，置200 mL 量瓶中，加20 mL 甲醇超声处理30 分钟使溶解，放至室温，加50%甲醇稀释至刻度，制成母液A。

2．5．2 对照品溶液制备 取母液A 3．00 mL，加50%甲醇稀释至10．00 mL 即得。

2．5．3 样品制备 取样品2、样品7 各3 份，精密称定，置100 mL 容量瓶中，精密加入黄芩苷母液A 25 mL，按2．2 项下供试品溶液制备方法制备样品溶液，上机测定，黄芩苷的回收率在92．9%～95．3%之间，平均回收率为94．3%，RSD为0．92%，结果见表1。

图5 黄芩苷线性图Fig 5 Baicalin linear graph

表1 加样回收率试验Tab 1 Recovries of Baicalin in preparation

2．6 精密度 重复性 取8 号样品（批号为20160308），按2．2 项下供试品溶液制备方法，制成供试品溶液，重复进样6 次，每次10 μL，按上述色谱条件进行测定，测定黄芩苷峰面积相对标准偏差RSD为0．21%，结果见表2［1］。

表2 精密度试验Tab 2 Precision test

2．7 稳定性试验 取4 号样品（批号为20180516），按2．2 项下供试品溶液制备方法，制成供试品溶液，立即测定，再在2、4、8、12、24 h 的时间点进行测定，结果表明，测定值在24 h 内基本稳定，RSD为1．96%，结果见表3［1］。

表3 稳定性试验Tab 3 Stability test

2．8 耐用性［1］

2．8．1 色谱柱、进样量的耐用性 取清肺止咳散（9号样品，批号为20180311），按2．2 项下供试品溶液制备方法制得样品溶液，按2．1 项下色谱条件，分别在PE 液相色谱仪上用waters 柱、安捷伦柱、PE柱，在waters 液相色谱仪上用waters 柱，进样测试含量，进样量分别为5、10 μL，结果RSD分别为1．72%、1．12%。结果见表4。

2．8．2 流速的耐用性 取清肺止咳散（10 号样品，批号为20180524），按2．2 项下供试品溶液制备方法制得样品溶液，按2．1 项下色谱条件，保持流动相比例不变，于0．8 mL／min 和1．2 mL／min 流速条件下进样5 μL 进行测试。二者测试结果相对偏差为0．71%，结果见表4。

2．8．3 流动相的耐用性 取清肺止咳散（10 号样品，批号为20180524），按2．2 项下供试品溶液制备方法制得样品溶液，将2．1 项下色谱条件中流动相比例调为50：50，其余保持不变，进样5 μL，进行测试，结果与原流动相比例测得结果相对偏差为0．0%。耐用性试验结果表明该方法能够耐受不同液相色谱仪，色谱柱，在进样量、流速、流动相比例等因素小范围变化情况下，测定清肺止咳散中黄芩苷的含量无明显差异，说明耐用性良好。

2．9 样品含量测定 取三家企业产品，每家三批共9 批样品，分别按2．2 项下方法制备对照品溶液及供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，上机测定峰面积，通过外标法计算黄芩苷的含量，结果见表5。

表4 耐用性试验Tab 4 Serviceability test

表5 样品含量测定结果Tab 5 Content determination results （n=2）

3 讨论与结论

3．1 含量测定成分的选择 清肺止咳散现收载于《中华人民共和国兽药典》2015年版二部，是由桑白皮、知母、黄芩等十味药材经粉碎、混合而制成的中药散剂，处方量320 g，其中黄芩45 g，占14．06%，为君药。黄芩的主要成分为黄芩苷，具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、降胆固醇、抗血栓形成、缓解哮喘、泻火解毒、止血、安胎、抗变态反应及解痉作用，也为哺乳动物肝脏涎酶的特异性抑制剂，具有调节某些疾病的作用，也具有较强的抗癌反应生理效能。黄芩苷分子式为C21H18O11分子量（446）适中，化学性质稳定，适于作为含量测定目标成分［3］。原质量标准无含量测定方法，为了更好地控制其质量，拟定采用HPLC 测定黄芩苷的含量，并对测定方法进行了系统的考察，该方法操作简便，黄芩苷在3．8～379 μg／mL 范围内线性关系良好，方法准确度、精密度、日内稳定性和耐用性均能达到检测要求。

3．2 样品前处理方法的选择 黄芩苷是一种黄酮类化合物，易溶于甲醇等有机溶剂。参考《中华人民共和国兽药典》2015年版二部银黄提取物口服液含量测定项下前处理方法，本试验采用先用少量甲醇超声提取，再用50%甲醇稀释，结果证明该方法能够较为完全地提取出清肺止咳散中的黄芩苷，并且阴性无干扰。

3．3 含量测定限度的确定 拟定为每1 g 清肺止咳散中含黄芩以黄芩苷计不得低于10．0 mg。黄芩药材收载于《中华人民共和国兽药典》2015年版二部，其含量限度规定为不得少于9．0%。实验室自制小样所用黄芩药材中黄芩苷含量为9．7%，折合到清肺止咳散中，理论上应为13．6 mg／g，实测值为13．1 mg／g，黄芩苷的转移率为96%。考虑到大生产实际，按转移率80%、黄芩药材中黄芩苷含量不低于9．0%计算，每1 g 肺止咳散中含黄芩苷应不得少于10．1 mg，取整数为10．0 mg。拟以此作为含量测定的限度。生产企业提供的9 批样品中，6 批含量超出此限度，3 批未达到此限度。因黄芩苷实际无毒，上限未作规定［1］［2］。

3．4 结论 用高效液相法测定清肺止咳散中黄芩苷的含量，方法简便，准确，灵敏度高，回收率好，可有效控制该制剂中主药黄芩的含量，含量限度暂定为每1 g 清肺止咳散中含黄芩以黄芩苷计不得低于10．0 mg［5］。