黄芪多糖注射液生物活性检测方法的分析与评价

元雪浈，马发顺，段沙沙，王军红，王小艳，李华岑，刘占通，周红霞，吴志明∗

（1．河南省兽药饲料监察所，郑州450000；2．安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳455000）

黄芪多糖是从传统中药黄芪中提取的有效成分，研究表明，黄芪多糖不仅可以促进动物免疫器官的发育，增加免疫细胞的数量，而且还能提高免疫细胞的功能，增强疫苗的免疫效果，从而起到提高自身免疫力、抵抗致病微生物侵袭的作用［1-3］。李朝辉等研究表明，在1日龄雏鸡日粮中添加黄芪多糖可以有效促进免疫器官的发育，提高外周血中免疫球蛋白含量和T 淋巴细胞数量［4］。闫春贤在黄芪多糖对ROSS308 肉仔鸡生长的影响实验中发现，黄芪多糖对体重增加不太明显，对免疫器官的增重前期有降低，后期有明显增重［5］。徐端红等在研究中同样发现，黄芪多糖可以增强断奶羔羊的免疫球蛋白的水平，提高抗病能力［6］。宣小龙在黄芪多糖提高干奶期奶牛乳腺免疫力的研究中发现，使用黄芪多糖可以提高干奶期奶牛乳腺免疫力能达到很好效果，并且对干奶期前的预防效果也很好［7］。高扬在研究中表明，饲料中添加不同水平的黄芪多糖，可以不同程度地提高脾脏系数［8］。在养殖业中将黄芪多糖作为饲料添加剂，可提高畜禽免疫力、促进饲料吸收利用，并提高畜产品质量［9］。侯晓礁等研究发现，在妊娠后期母猪饲料中添加黄芪多糖粉，可以有效提高妊娠母猪的窝均产仔数、窝均活仔数和窝均活仔质量［10］。然而，对于黄芪多糖的质量检测方面的研究相对较少，过去主要侧重于含量的测定以及性状鉴别上。2013年《兽药国家标准（化学药品、中药卷）》第一册首次将黄芪多糖生物活性检测列为商品化黄芪多糖注射液的检验项目，《中国兽药典2015 版（二部）》首次将其生物活性检测纳入黄芪多糖注射液的必检项目。目前，关于黄芪多糖注射液生物活性检测方面的报道很少，特别是对其方法的分析与评价还未见报道。本试验采用《中国兽药典2015 版（二部）》提供的方法，对河南省4 家兽药厂提供的黄芪多糖样品进行了生物活性检测，并增加了胸腺项目检测作为参考；对检测结果进行统计处理，对黄芪多糖生物活性现实检测方法进行分析和评价，期望为今后黄芪多糖注射液生物活性检测方法的应用与改进提供参考。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验动物 昆明鼠，SPF 级，体重18～20 g，雌雄各半，质量合格证号为：NO．41003100005184，购自河南省实验动物中心；SPF 级全价饲料，购自河南省实验动物中心。屏障环境饲养，环境温度24～25 ℃，相对湿度40%～50%；垫料每周更换3次，提供充足的无菌饮水。

1．1．2 试验仪器和药品 精密分析天平（AB204-N），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；一次性使用无菌注射器（型号1mL），河南曙光健士医疗器械集团股份有限公司生产；4 种黄芪多糖样品，规格：以葡萄糖（C6H12O6）计10 mL ∶0．1 g，由河南省各兽药厂提供；生理盐水，河南科伦药业有限公司生产。

1．2 方法

1．2．1 试验设计 本试验选用4 种黄芪多糖样品（A、B、C、D），每种样品各自独立进行试验设计，均设试验组和对照组。在对每一种样品进行检测试验时，选择16 只体重相近的昆明鼠，将其随机分为2 组，每组8 只，一组为试验组，另一组为对照组，整个试验共用昆明鼠64 只。4 个试验组分别用4 种黄芪多糖样品处理，每天每只腹腔注射黄芪多糖0．5 mL，连续注射7 d；4 个对照组每只昆明鼠注射等量的生理盐水。

1．2．2 脾指数和胸腺指数的计算 最后一次注射黄芪多糖注射液24h 后处死昆明鼠，依次称量每只昆明鼠的体重、脾脏重和胸腺重，并计算脾指数和胸腺指数。脾指数＝脾脏重（mg）／体重（g）；胸腺指数＝胸腺重（mg）／体重（g）。再进一步采用简单算术平均法计算各组的平均脾指数和平均胸腺指数。按照《中国兽药典2015 版（二部）》提供的方法判定样品是否合格，即：试验组与对照组平均脾指数之差大于或等于2 为合格，小于2 为不合格。

1．2．3 统计分析方法 试验组与对照组间各项目的显著性检验采用t检验法；胸腺重与脾脏重之间、两种指数之间的相关性分析采用相关系数法，4种样品间的差异显著性检验采用单因素方差分析法，多重比较采用Duncan 新复极差法。

1．2．4 所用软件 使用Excel2010 软件进行初步数据统计、t 检验和相关系数计算；使用DPS7．05 软件进行方差分析和多重比较。文中P＜0．05 用∗表示，P＜0．01 用∗∗表示。

2 结果与分析

2．1 4 种黄芪多糖样品生物活性检测结果 4 种黄芪多糖样品生物活性检测结果见表1。4 种样品试验组与对照组两指数的差值见表2。可以判断出样品C 和D 为生物活性检测合格样品，而A 和B为生物活性不合格样品。从胸腺指数的表现来看，样品A、B 的差值为负值，样品C、D 的差值均为正值。进一步计算出4 种样品脾脏指数的差值与胸腺指数的差值间的相关系数为0．9494（P＜0．05）。

2．2 胸腺重与脾脏重及两种指数之间的相关性对4 个样品试验组和对照组的脾脏重和胸腺重及两种指数间分别进行相关分析结果见表3。可见，无论试验组还是对照组脾脏重和胸腺重之间相关性均较弱，但对照组无论两器官重间还是两指数间均存在负相关倾向，而试验组两器官重间和两种指数间均呈正相关。

2．3 试验组与对照组的对比分析 从各检测项目试验组与对照组的t检验结果来看，体重方面，除了样品C 差异极显著外，其余3 种样品均差异不显著（P＞0．05）；脾重和脾指数方面，4 种样品大多表现出显著（P＜0．05）或极显著（P＜0．01）的差异；胸腺重和胸腺指数方面，差异均不显著（P＞0．05），但样品A、B 的统计量t值为负值，而合格样品C、D的t值为正值。

2．4 4 种样品间的对比分析 方差分析显示，对照组胸腺重差异不显著（P＞0．05），试验组体重和对照组胸腺指数两项差异显著（P＜0．05），其余各项均差异极显著（P＜0．01）。4 种样品间各测定项目的比较结果见表4和表5。可以看出C 样品的对照组体重最大，且与其它3 种样品的对照组有极显著差异，对照组的脾脏重和脾指数都是B 样品最大，与样品C、D 间无显著差异（P＞0．05），而与样品A 间有极显著差异（P＜0．01）。试验组样品D 的各项指标均排在首位，样品A 的各项指标均排在最后，且二者之间有极显著差异（P＜0．01）。按照《中国兽药典2015 版（二部）》标准判断，样品D、C 合格，样品B、A 不合格，但样品B、A 也具有一定的生物活性。合格样品C、D 间在体重、脾重和脾指数方面均差异不显著（P＞0．05），而在胸腺重和胸腺指数两方面差异显著（P＜0．05）。

3 讨论与结论

黄芪多糖具有促进动物生长的作用，并含未知生长因子（UGF）可显著提高畜禽的生长速度，促进脾脏发育，提升机体抵抗力，这些在本试验中得到部分证实［4，11］。

表1 4 种黄芪多糖样品生物活性检测结果Tab 1 Results of 4 Astragalus polysaccharide samples＇bioactivity

表2 4 种黄芪多糖样品两种指数试验组与对照组的均值之差Tab 2 Mean difference of Astragalus polysaccharide samples＇two index between test groups and control groups

表3 脾脏重与胸腺重及两种指数间的相关系数Tab 3 Correlation coefficient among spleen weight ，thymus weight and two indexes

表4 4 种黄芪多糖样品试验组间各测定项目的比较结果Tab 4 Comparison results of test item among the four sample test groups

表5 4 种黄芪多糖样品的对照组间各测定项目的比较结果Tab 5 Comparison results of test item among the four sample control groups

试验结果表明，黄芪多糖对脾脏的发育具有促进作用，这一点与闫春贤和高阳的研究结果相一致［5，8］，而对胸腺的促进作用不明显或具有延缓胸腺退化的作用，并且脾脏指数的差值和胸腺指数的差值间存在显著的正相关关系，这说明在进行黄芪多糖生物活性检测时，胸腺指数具有一定的参考价值，具体标准有待进一步研究确定。另外，脾指数可灵敏反映出黄芪多糖的生物活性，而胸腺指数反映不灵敏。试验组样品B 在体重、胸腺重和胸腺指数方面的良好表现，可能与样品本身的质量及试验误差有关，4 种样品间存在差异性，这可能与各厂家生产黄芪多糖的工艺不同、黄芪多糖样品的质量差异有关。

对照组间各测定项目上均有差异性，可能是由于试验条件的限制和动物福利要求，减少了试验动物使用数量，在试验动物选择和分组环节未能很好的控制试验误差，对昆明鼠的日龄、性别等因素没有足够重视，再加上昆明鼠本身会存在一定的个体差异，这可能是各对照组间测定项目均有不同程度差异的重要因素。

在实际操作方面，《中国兽药典2015 版（二部）》提供的检测方法具有可操作性。从解剖的角度来说，脾脏相较于其它脏器更易摘取。此外，本试验运用《中国兽药典2015 版（二部）》提供的方法对河南省4 家兽药厂提供的黄芪多糖样品进行生物活性检测，检测出了2 个生物活性合格样品和2 个生物活性不合格样品，进一步证实了该方法的可行性。

使用《中国兽药典2015 版（二部）》提供的方法，对4 种黄芪多糖样品进行生物活性检测，结果是2 个样品合格2 个样品不合格。黄芪多糖有促进昆明鼠脾脏生长发育的作用，或可减缓其胸腺退化的进程。脾重和胸腺重之间、脾指数和胸腺指数之间均存在弱的正相关关系。脾指数能灵敏反映黄芪多糖的生物活性，用脾指数作为黄芪多糖生物活性检测指标是可行的。胸腺指数、脾指数在试验组与对照组的差值之间存在正相关关系，胸腺指数可以作为黄芪多糖生物活性检测的参考指标。