超高效液相色谱-紫外检测法测定肾复康合剂中落新妇苷和芦丁的含量

魏秀丽丁新仁徐恩民∗栾明娜李有志孙亚磊张传津

（1．山东省兽药质量检验所，济南250022；2．山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南250022；3．山东齐发药业有限公司，济南250400；4．青岛蔚蓝生物股份有限公司，山东青岛266000）

肾复康合剂由土茯苓、槐花、白茅根、益母草、广藿香等中药经提取加工所制成的口服液体制剂，本处方来源于中华人民共和国药典2015年版一部“肾复康胶囊”，具有清热利尿、益肾化浊的功能［1］。经过提取工艺参数的优化、药学药效、靶动物鸡安全性及稳定性试验等的研究，开发成一种新兽药合剂，主成分土茯苓具有解毒除湿通利关节的作用，槐花具有凉血止血之妙，在中兽医临床上用于防治由鸡大肠杆菌病、鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎、鸡病毒性肾炎或中毒、营养代谢障碍等引起的鸡肾肿湿热证，经临床试验证实在靶动物鸡上兑水饮用［2］，安全有效经济方便。以往常常采用普通高效液相色谱方法检测土茯苓和槐花主成分中落新妇苷和芦丁的含量［3-6］，时间长，检测结果慢。本实验开发了超高效液相色谱-紫外检测法测定肾复康合剂中落新妇苷和芦丁的含量，快速可行，经济环保。

1 材料与方法

1．1 药品及试剂 落新妇苷（批号111574-201404，20 mg，中国食品药品检定研究院）；芦丁（批号111868-201401，20 mg，中国食品药品检定研究院）。甲酸、甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯；超纯水。肾复康合剂，批号20150601，青岛蔚蓝生物股份有限公司小试生产产品。

1．2 仪器 分析天平：感量0．00001 g；仪器Waters AcquityTM Ultra performance LC 超高效液相色谱仪；Aglient1260 高效液相色谱仪。

1．3 方法

1．3．1 供试品溶液制备 精密量取本品0．5～1．0 mL，加60%甲醇稀释至50 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1．3．2 标准储备液的制备 精密称取落新妇苷10．03 mg，加60%甲醇至10 mL，精密称取芦丁9．98 mg，加60%甲醇至10 mL。

1．3．3 标准工作液的制备 取适量标准储备液，用60%甲醇稀释，制备成系列浓度为：落新妇苷2、5、10、25、50、75 μg／mL，芦丁4、10、20、50、100、150 μg／mL标准工作液，绘制标准曲线。

1．3．4 色谱操作条件及参数 色谱柱：ACQUITY UPLCTM C18 色谱柱（2．1mm×100 mm，1．7 μm）；流动相A：乙腈；流动相B：0．1%甲酸溶液，进行梯度洗脱；流速：0．35 mL／min；进样量：5 μL；柱温：35 ℃，进样室温度10 ℃。二极管阵列检测器，检测波长为204 nm。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件表Tab 1 Table of gradient eluting conditions

1．3．5 重复性试验和精密度试验 配制50 μg／mL落新妇苷100 μg／mL 芦丁对照品溶液，重复配置6 份，进样，计算落新妇苷、芦丁峰面积RSD。配制50 μg／mL 落新妇苷100 μg／mL 芦丁对照品溶液，重复进样6 次，计算落新妇苷、芦丁峰面积RSD。

1．3．6 检测限和定量限的测定 对落新妇苷和芦丁的标准工作液，进行UPLC 的分析，并逐级降低其浓度，以溶液检测时的信噪比（S／N）分别大于等于3 和10 作为药物的检测限和定量限。

1．3．7 不同色谱条件样品检测比较 使用普通的液相色谱仪和超高效液相色谱仪在不同的色谱条件下运行，对同一合剂样品中两主成分落新妇苷和芦丁的含量、检测波长和出峰时间分别进行比较。

1．3．8 稳定性试验 进样室温度设置到10 ℃。取1．3．5 项下50 μg／mL 落新妇苷100 μg／mL 芦丁溶液，在10 ℃放置3、6、12、24 h；各进样2 μL，计算落新妇苷、芦丁峰面积RSD。

1．3．9 回收率的测定 精密称定已知含量（原有量）的同一批合剂样品0．5 mL 共6 份，加入落新妇苷储备液1．0 mL 和芦丁储备溶液2．5 mL，按供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液50 mL，进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，计算落新妇苷和芦丁的回收率和RSD。

1．3．10 色谱柱耐受性 本实验选择了35 ℃流速0．34、0．35、0．36 mL／min 测试色谱柱保留时间的耐受性。并选择流速0．35 mL／min 保持不变，柱温35、38、40 ℃进样，测试色谱柱的耐受性。

2 结果与分析

2．1 色谱分离 在优化的色谱条件下，测得落新妇苷和芦丁色谱峰峰形良好，且均达到基线分离，满足分离度要求。

2．2 线性 在选定的色谱条件下，使用梯度洗脱的方法，可以有效地分离目的峰，落新妇苷在2～75 μg／mL 的范围内标准曲线方程为y＝88300x+77000，Y为落新妇苷峰面积，X为落新妇苷的浓度，其相关系数R2大于0．998，线性良好；芦丁在4～150 μg／mL 的范 围 内 标准 曲 线 为y＝43800x+126000，Y为芦丁峰面积，X为芦丁的浓度，其相关系数R2大于0．996，线性良好。

2．3 重复性试验和精密度试验 配制50 μg／mL落新妇苷100 μg／mL 芦丁对照品溶液，重复6 份，进样，计算落新妇苷、芦丁峰面积RSD分别为0．63%、0．59%，满足实验要求。取50 μg／mL 落新妇苷100 μg／mL 芦丁对照品溶液，重复进样6 次，计算落新妇苷、芦丁峰面积RSD为0．23%、0．26%，满足实验要求。

2．4 检测限和定量限 1 μg／mL 落新妇苷2 μg／mL芦丁对照品溶液信噪比＞3 为检出限，2 μg／mL 落新妇苷4 μg／mL 芦丁对照品溶液信噪比＞10 为定量限。

2．5 不同色谱条件样品检测结果比较 对同一合剂样品中两主成分落新妇苷和芦丁的含量、检测波长和出峰时间分别进行了比较，结果如表2所示。

表2 不同色谱条件检测结果表（n=6）Tab 2 Test results at different chromatographic parameter （n=6）

高效液相色谱运行条件按照中华人民共和国药典方法进行［1］。由于两种色谱方法均已通过其方法学验证，均可以准确控制其指标成分。从检测效率上看，优选超高效法（UPLC）色谱图见图1～图2。普通色谱法采用了双波长检测落新妇苷和芦丁的含量，色谱图见图3～图4。

2．6 稳定性试验 落新妇苷、芦丁峰面积RSD为0．47%、0．58%，满足实验要求。

2．7 加样回收试验结果 落新妇苷和芦丁的平均回收率为98．33%和97．14%，RSD分别为0．88%和1．18% （表3～表4）。

图1 75 μg／mL 落新妇苷150 μg／mL 芦丁对照品溶液色谱图（204 nm）Fig 1 Chromatogram of reference solution of 75μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin at 204 nm

图2 肾复康合剂样品色谱图204 nmFig 2 chromatogram of Shenfukang mixture sample at 204 nm

图3 高效液相色谱法 对照品色谱图Fig 3 chromatogram of reference standard by HPLC

图4 高效液相色谱法 肾复康合剂色谱图Fig 4 Chromatogram of Shenfukang mixture by HPLC

表3 落新妇苷加样回收率试验结果Tab 3 Test results of recovery rate of astilbin

表4 芦丁加样回收率试验结果Tab 4 test results of Recovery of rutin

2．8 色谱柱耐受性 本实验选择了35 ℃流速0．34、0．35、0．36 mL／min 进行进样测试，保留时间如表5所示，流动相流速的微小变化对保留时间影响不大，最终选择0．35 mL／min。

本实验选择流速0．35 mL／min 保持不变，35、38、40 ℃下进样测试，保留时间如表6所示，分离度均满足要求。考虑到色谱柱的耐受性，最终选择35 ℃。

表5 不同流速主成分保留时间表Tab 5 Retention time of principal components at different flow rate

表6 不同柱温主成分保留时间表Tab 6 Retention time of principal components at different column temperatures

3 讨论与结论

3．1 检测波长的选择 芦丁、落新妇苷对照品和肾复康合剂样品待测液，在2．1 项条件下，色谱保留时间为4．884、5．760 min 左右，分离度均满足要求（图1～图2、图5～图8）。光谱图如图9所示。由色谱图和光谱图可以看出对照品和样品中，257 nm落新妇苷响应值很低，291 nm 芦丁响应值较低，定量波长为顾及两者相应值都高，定为204 nm（204 nm 基线噪音干扰并不明显），峰面积见表7。

波长选择方面，比较了204、291、257 nm 三个波长下落新妇苷和芦丁的峰面积，考虑到两种目标产物的检测，本方法最终选择了波长204 nm，光谱图亦提示在这一波长处两种成分均有较大吸收，因此，检测波长由药典上的双波长简化为单波长。

图5 75 μg／mL 落新妇苷150 μg／mL 芦丁对照品溶液色谱图（257 nm）Fig 5 Chromatogram of reference solution of 75 μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin at 257 nm

图6 75 μg／mL 落新妇苷150 μg／mL 芦丁对照品溶液色谱图（291 nm）Fig 6 Chromatogram of reference solution of 75 μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin at 291 nm

图7 肾复康合剂样品色谱图（出峰顺序：芦丁、落新妇苷）257 nmFig 7 Chromatogram of Shenfukang Mixture（peak sequence：rutin，astilbin） at 257 nm

图8 肾复康合剂样品色谱图（出峰顺序：芦丁、落新妇苷）291 nmFig 8 Chromatogram of Shenfukang Mixture（peak sequence：rutin，astilbin） at 291 nm

图9 75 μg／mL 落新妇苷150 μg／mL 芦丁对照品溶液光谱图Fig 9 Spectrogram of reference solution of 75μg／mL astilbin and 150μg／mL rutin

表7 与药典规定波长下比较相应峰面积表Tab 7 comparison of peak response at the wavelength specified in Pharmacopoeia

3．2 流动相的选择 在色谱条件流动相的选择上，分别考察了有机相甲醇和乙腈及找到各自适合的比例，发现同一样品采用乙腈洗脱相比甲醇，色谱图中目标峰响应信号相对低一点，但根据两种溶剂的截止波长甲醇205 nm 和乙腈190 nm，因此，最终选择了乙腈-0．1%甲酸系统。

本实验选择了超高效液相色谱-紫外检测法对肾复康合剂中落新妇苷和芦丁进行定性和定量测定。与普通高效液相色谱方法相比，鉴别增加了光谱法；二是定量的色谱图出峰保留时间在5 min 左右，每针运行时间10 min 足够，流速0．35 mL／min；而普通液相每针运行35 min，流速1．0 mL／min；超高效液相色谱方法比普通高效液相色谱方法运行时间缩短25 min，每运行一针流动相节省31．5 mL。在废液处理高成本的今天，超高效液相色谱方法更有优势，更经济和快捷。

综上所述，使用超高效液相色谱法，对肾复康合剂中落新妇苷和芦丁进行定性和定量测定，方法快速，可以作为企业内控标准方法，在产品工艺参数不断调整优化的过程中，具备精准快捷、经济环保的特点，可有效控制肾复康合剂的质量。