中波紫外线诱导HaCaT细胞自噬的研究

王超鹏 蒋丽君 陈富强 周美娟

南方医科大学公共卫生学院放射医学系，广东省热带病研究重点实验室（广州510515）

日光中的紫外线，尤其是中波紫外线（ultraviolet radiation b，UVB），是造成人体表皮细胞损伤最常见的环境因素之一。占表皮细胞90%的角质形成细胞是皮肤表皮的重要组成部分，同时也是UVB的主要靶细胞［1］。UVB 可通过氧化应激，DNA 损伤等引起辐射损伤［2-3］，甚至诱发皮肤癌［4］。

自噬，又称“自食”，是机体细胞在生长因子或营养素缺乏、缺氧、内质网应激等有害刺激下所发生的自稳过程，是真核生物中进化保守的对细胞内的物质进行转运、降解和重新利用的过程［5］。生理情况下，细胞自噬性降解可维持机体的稳态，但外界因素诱导的自噬失调可能与肿瘤、感染、神经退行性病变等疾病相关。既往研究中，UVB 对皮肤细胞的凋亡诱导效应研究较为透彻，但UVB对皮肤细胞自噬的诱导研究较少。因此，阐明UVB 和自噬在皮肤慢性损伤中的作用及其机制尤为重要。本研究以HaCaT 细胞为研究对象，基于预实验结果，采用半数红斑剂量，即30 mJ/cm2UVB 照射为处理因素，深入探讨UVB 对HaCaT 细胞自噬的诱导效应及自噬与凋亡的相互作用关系，以期为UVB 的辐射损伤治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.2 细胞培养与传代 HaCaT 细胞培养在含体积分数为10%的胎牛血清、1 × 105U/L 的青霉素、100 mg/L 链霉素的DMEM 高糖培养基中，于37 ℃、5%的CO2培养箱中常规培养。待细胞长至80%～90%时，PBS 洗涤两次后加入0.25%胰酶消化，待细胞变圆后加入DMEM 终止消化，1 200 r/min 离心5 min，离心收集细胞，传代后进行后续实验。

1.3 细胞处理

1.3.1 紫外照射取对数生长期的HaCaT 细胞 用PBS 洗涤两次，加入一定量的PBS（其中6 cm 皿：1.9 mL；96 孔板：28 μL），置于距UVB 光源垂直距离40 cm 的紫外光源箱体指定位置，功率密度为165 μW/cm2，照射相应时间。照射结束后吸弃PBS，加入完全培养基，继续培养至相应时间点进行后续实验。

1.3.2 CCK-8 法检测细胞增殖 取对数生长期的HaCaT 细胞按每孔5 × 103个细胞接种于96 孔板，常规培养24 h 后，接受UVB 处理，对应时间点加入10 μL/孔CCK-8 溶液，37 ℃恒温孵育2 h 后，酶标仪检测450 nm 波长处吸光度。实验重复3 次。

1.3.3 透射电镜检测自噬小体 30 mJ/cm2UVB 处理24 h 后收集贴壁细胞。PBS 洗涤3 次后，将细胞刮下，1 200 r/min 离心5 min，吸弃上清后加入4%戊二醛固定过夜，经漂洗、脱水、浸透、包埋，超薄切片后进行透射电镜观察并拍照。

1.3.4 MDC 染色标记自噬小体囊泡 30 mJ/cm2UVB 处理24 h 后，PBS 洗涤细胞2 次，加入0.05 mmol/L 的MDC 染料，37 ℃避光孵育30 min，PBS 缓冲液漂洗两次，倒置荧光显微镜下观察细胞并拍照。每孔至少选取3 个视野，实验重复3 次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测 30 mJ/cm2UVB处理24 h后收集细胞。100 μL 预冷的1×Annexin V binding buffer 重悬细胞后，分别加入5 μL Annexin V FITC 和5 μL PI 混匀，室温避光孵育15 min，加入400 μL 1×Annexin V binding buffer 混匀后上机检测。

1.3.6 Western Blot 检测自噬和凋亡相关蛋白表达 HaCaT 细胞长至70%～80%融合度时，接受UVB 照射。分别在照射后6、12、24、36、48 h 收集细胞，提取细胞总蛋白。经煮沸变性后行SDSPAGE 凝胶电泳，并转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene，PVDF）膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST 漂洗3 次后，加入相应二抗室温孵育2 h，ECL 发光试剂盒检测发光强度。

注意不要遗漏三防门门洞四角部45°的构造筋。内外侧每角放置1Φ 16 mm，L=1 000 mm的斜向钢筋。当墙厚D≤400 mm时，每角2Φ 16 mm；D﹥400 mm时，每角3Φ 16 mm。

1.4 统计学方法 统计学分析采用SPSS 20.0 统计软件分析处理。计量资料以均数±标准差表示。采用单因素方差分析进行组间比较，两两比较采用SNK 法，方差不齐时使用Games-Howell 法校正。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UVB 能够诱导HaCaT 细胞自噬

2.1.1 透射电镜观察自噬小体 30 mJ/cm2UVB 照射24 h 后，HaCaT 细胞内可见双层膜结构的自噬小体，内含大量细胞器和折叠蛋白（图1）。

图1 透射电镜观察30 mJ/cm2 UVB 照射后HaCaT 细胞内自噬小体的情况Fig.1 The changes of autophagosomes in HaCaT cells under TEM

2.1.2 MDC 染色观察细胞自噬小体囊泡 与对照组相比，30 mJ/cm2UVB 照射HaCaT 细胞24 h后，MDC 染色可见HaCaT 细胞中的酸性自噬囊泡明显增多，荧光强度加强，说明UVB 能够诱导Ha-CaT 细胞自噬（图2）。

图2 MDC 染色检测细胞自噬Fig.2 Detection of autophagy by MDC staining

2.1.3 Western Blot 检测自噬相关蛋白表达Western Blot 结果显示，30 mJ/cm2UVB 照射后，LC3-Ⅱ、Beclin-1 以及SQSTM1 的蛋白表达水平显著升高，其中LC3-Ⅱ、SQSTM1 在照后24 h 达到最高点，48 h 表达量下降，Beclin-1 在照后48 h 依然维持在较高水平（图3）。

2.2 UVB 诱导了HaCaT 细胞保护性自噬

2.2.1 运用3-MA抑制自噬后，增加了UVB诱导的HaCaT 细胞凋亡 3-MA 是一种经典的Ⅲ型PI3K抑制剂，作用于Vps34 和PI3Kγ，会阻断自噬体的形成［6］。运用3-MA 抑制自噬后，LC3-Ⅱ蛋白水平表达下降（图4C），自噬水平降低，UVB 对HaCaT细胞的凋亡诱导作用增加（P＜0.05，图4A），细胞增殖减慢（P＜0.05，图4B），凋亡蛋白Cleaved-PARP 表达增加（图4C）。

图3 Western Blot 检测自噬相关蛋白的表达Fig.3 Detection of autophagy-related Protein markers by Western Blot

图4 运用3-MA 抑制自噬对细胞增殖和凋亡的影响Fig.4 Inhibition of autophagy by 3-MA on cell proliferation and apoptosis

2.2.2 运用siATG5 抑制自噬后增加了UVB 诱导的HaCaT 细胞凋亡 自噬相关基因ATG5 在自噬小体的形成中发挥至关重要的作用，它与ATG12共同形成ATG5-ATG12 复合物，帮助自噬体膜伸展扩张［7］。运用ATG5 小干扰RNA（siATG5）抑制自噬后，LC3-Ⅱ蛋白水平表达下降（图5C），自噬水平降低，UVB 对HaCaT 细胞的凋亡诱导作用增加（P＜0.05，图5A），细胞增殖减慢（P＜0.05，图5B），凋亡蛋白Cleaved-PARP 表达增加（图5C）。

图5 运用siATG5 抑制自噬对细胞增殖和凋亡的影响Fig.5 Inhibition of autophagy by siATG5 on cell proliferation and apoptosis

2.3 UVB通过AMPK/mTOR信号通路诱导HaCaT细胞自噬 30 mJ/cm2UVB 处理HaCaT 细胞24 h后，用Western Blot 检测AMPK/mTOR 信号通路节点蛋白的表达水平见图6。UVB 照射后，AMPK、p-ULK1、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达增加，p-mTOR蛋白表达降低，而总mTOR 和ULK1 蛋白表达没有明显变化。运用3-MA 和siATG5 抑制自噬后，AMPK、p-ULK1、Beclin-1、LC3-Ⅱ表达水平下降，p-mTOR 蛋白表达增加。

3 讨论

UVB 是皮肤癌的主要原因之一［8］，其对皮肤的损伤作用被广泛报道。研究发现UVB 能够通过诱导细胞DNA 损伤、死亡受体激活、活性氧簇（ROS）等方式导致细胞死亡［9-10］。凋亡与自噬是细胞中存在的两种程序性死亡方式，是正常的生理和病理的关键［11］。凋亡，又称为Ⅰ型程序性死亡，在维持内环境稳定的过程中发挥重要作用。自噬，又称为Ⅱ型程序性细胞死亡，是机体细胞面对营养因子缺乏、细胞器功能障碍及病原体入侵时的自稳过程。目前通常认为两者呈如下关系：（1）细胞通过诱导自噬抑制或推迟细胞凋亡的发生，促进细胞的存活；（2）细胞自噬通过诱导凋亡基因的活化，加速凋亡进程，促进细胞死亡；（3）二者虽有共同的上游通路，但功能独立，共同维持细胞内环境的稳定。既往研究中，CAVINATO 等［12］研究发现，自噬在UVB 诱导的皮肤成纤维细胞（HDF）衰老的早期阶段被激活，阻断细胞内ROS的积累可抑制UVB 诱导的自噬。而CHEN 等［13］研究发现UVB 通过雷帕霉素（mTOR）非依赖性途径下调ULK1 和ATG7 的表达，抑制表皮HEKs 细胞的自噬。笔者前期研究发现，UVB 能够通过caspase-3、PARP 等凋亡通路诱导HaCaT 细胞发生凋亡，并呈现剂量和时间依赖关系。但UVB 对Ha-CaT 细胞自噬的诱导效应及其通路研究却未阐明，因此，本研究就UVB 对HaCaT 自噬的诱导效应及其与凋亡的关系展开具体研究。

图6 Western Blot 检测AMPK/mTOR 通路关键蛋白的表达Fig.6 Detection of key proteins in AMPK/mTOR pathway by Western Blot

透射电镜可以直观的检测细胞内的自噬小体及自噬溶酶体的结构形态和数量［14］。LC3-Ⅱ、Beclin-1、SQSTM1 是细胞自噬的标志蛋白，也是目前公认的自噬检测生物标志物。其中，Beclin-1 在自噬起始时发挥重要作用，是形成自噬体的必需分子之一。LC3B-Ⅱ则分布于自噬体内膜和外膜上，其蛋白表达量可反映细胞自噬活性的强弱。SQSTM1，是一组由SQSTM1 基因编码的泛素结合蛋白，通过与LC3-Ⅱ的C 端的LIR 结构域结合，共同参与自噬体与溶酶体的融合及降解［15］。

本研究采用半数红斑剂量UVB（30 mJ/cm2）照射HaCaT 细胞，结果显示：30 mJ/cm2UVB 照射后，HaCaT 细胞内可见双层膜结构的自噬小体，内含大量细胞器和折叠蛋白。LC3B-Ⅱ、Beclin-1 和SQSTM1 的表达均增加，呈一定时间依赖关系。其中，LC3-Ⅱ和SQSTM1 在照后24 h 达到最高点，36 h 表达开始下降。Beclin-1 在照后48 h 依然维持在较高水平。综合分析，UVB 照射诱导HaCaT细胞发生了自噬。为了进一步验证UVB 诱导的自噬对HaCaT 细胞生存的影响，本研究采用3-MA 和ATG5 小干扰RNA（siATG5）抑制UVB 诱导的自噬，观察自噬在HaCaT 细胞生存中发挥的作用。研究发现，利用自噬工具药3-MA 和siATG5 抑制自噬后，UVB 诱导的HaCaT 细胞凋亡增加，细胞增殖减慢，凋亡蛋白Cleaved-PARP 表达增加，这表明UVB诱导的自噬在HaCaT 细胞生存中发挥保护性作用。

既往研究［16］表明，AMPK/mTOR 通路在细胞自噬的调控中发挥重要作用。在对自噬的调控中，AMPK 和mTOR 既相互独立，又具有上下游的关系。一方面，AMPK 可直接激活ULK1-Atg13-FIP200 复合体，促进Beclin-1 蛋白的表达，诱导自噬发生；另一方面，AMPK 还可直接抑制mTOR 复合体1（mTOR complex 1，mTORC1）的活性，促进自噬发生［17］。本研究中，UVB 照射引起AMPK、p-ULK1 蛋白表达增加，p-mTOR 蛋白表达量下降。运用3-MA 和siATG5 抑制自噬后，与单独照射组相比，AMPK、p-ULK1 蛋白表达量下降，p-mTOR 蛋白表达量增加，这表明UVB 照射也是通过AMPK/mTOR 通路诱导自噬发生，其可能的机制为：UVB照射诱导AMPK 表达增加，AMPK 表达增加抑制mTOR 蛋白的磷酸化，促进ULK1 的磷酸化和Beclin-1 的表达增加，促进HaCaT 细胞发生自噬。

综上所述，UVB 能通过AMPK/mTOR 信号通路诱导HaCaT 细胞发生自噬，该自噬对HaCaT 细胞呈保护作用。有关其他自噬信号通路是否参与了UVB 诱导的皮肤细胞自噬，笔者将在后续工作中开展相关研究。