番石榴叶总黄酮对AngⅡ诱导的乳鼠心肌细胞肥大的抑制作用及机制

刘敏敏，周迎春

(1天津市宝坻区人民医院，天津301800；2南方医科大学)

早期心肌细胞肥大是心脏负荷增加时的主要代偿机制之一，随着心脏负荷增加，可发展至心衰。阻断胞外信号通路介导的心肌细胞肥大效应，对防治心力衰竭和心脏事件具有重要意义[1，2]。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是体内重要的内分泌因素，不仅调节着心血管系统的生理功能，在心肌肥厚和心力衰竭过程中也发挥重要作用[3，4]。AngⅡ对心肌细胞的作用主要是通过血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)介导的，AT1R活化后可激活细胞膜的磷脂酶系统，生成三磷酸肌醇和二酰基甘油，后两者使胞内Ca2+浓度升高及蛋白激酶C(PKC)活化。活化的PKC可转位入核，调节核内的基因表达，促进心肌细胞肥大[5]。AT1R-PKC作为介导心肌细胞肥大的经典通路，备受关注。药理研究显示，黄酮类化合物具有抗心脑血管病、抗氧化、镇痛、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等作用，临床可用于治疗冠心病、心律失常、高血压、脑栓塞、肝炎、肝硬化、肝癌等多种疾病[6]。已有研究证实，榅桲总黄酮、水杉总黄酮、荞麦花总黄酮具有抗大鼠心肌肥厚的作用[7～9]。中药番石榴叶中含有β-谷甾醇、槲皮素、番石榴苷、无色矢车菊素、番石榴酸等成分，黄酮类化合物为其主要成分,目前关于番石榴叶总黄酮对抗心肌肥大的作用尚未见报道。2015年1～10月，我们采用AngⅡ诱导乳鼠心肌细胞肥大，观察番石榴叶总黄酮对心肌细胞肥大的抑制作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级Wistar乳鼠，出生1～3 d，购自南方医科大学实验动物中心。番石榴叶总黄酮(纯度55.22%)由本课题组前期提取并保存，使用时加入DMSO溶解，用DMEM稀释。AngⅡ购自Sigma公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青，DMEM高糖培养基购自Gibco公司，胰蛋白酶购自AMRESCO公司。主要仪器为CO2培养箱、L420台式低速自动平衡离心机、倒置相差显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞的分离与培养 取乳鼠心脏，清洗后剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块。加入胰蛋白酶消化，弃上清液，获得心肌细胞。加入0.01%胰蛋白酶吹打混匀，制成细胞悬液，调整细胞密度为1×106/孔，置于37 ℃、5% CO2孵箱培养24 h。更换含10% FBS的DMEM高糖培养基继续培养24～48 h，每24 h换液1次。加入含0.1% FBS的DMEM进行无血清培养48 h。

1.2.2 番石榴叶总黄酮最佳作用浓度的确定 采用MTT法。将心肌细胞按2×104/孔接种于96孔板中，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h。更换含1%血清的DMEM培养液，37 ℃继续孵育24 h，使细胞进入对数生长静止期。弃上清，加入含15%小牛血清的DMEM培养液和50、100、150、200、250 μg/mL番石榴叶总黄酮培养24 h。于药物刺激结束前4 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL。吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上540 nm波长处测定吸光度(OD)值。结果显示，在50～200 μg/mL剂量范围内，细胞增殖能力逐渐增强，以200 μg/mL时最强，250 μg/mL时细胞增殖能力开始下降。150、200、250 μg/mL组间两两比较差异无统计学意义(P均>0.05)。故本实验选取50、100、150 μg/mL作为番石榴叶总黄酮的低、中、高剂量组。

1.2.3 细胞分组与处理 取对数生长期心肌细胞，分为模型组和番石榴叶总黄酮低、中、高剂量组。模型组加入AngⅡ 0.1 μmol/L培养24 h诱导心肌细胞肥大，番石榴叶总黄酮低、中、高剂量组先分别加入番石榴叶总黄酮50、100、150 μg/mL预处理24 h，然后加入AngⅡ 0.1 μmol/L培养24 h。另设正常对照组，加入含10% FBS的DMEM培养48 h。

1.2.4 细胞面积测算 采用免疫荧光染色法。收集各组细胞，吸弃培养液，加入4%多聚甲醛固定，PBS洗涤。加入封闭液封闭60 min，Actin抗体溶于1% BSA-PBS中(1∶500)，摇床上缓慢摇动孵育2 h；羊抗小鼠IgG-FITC加入(1∶300)，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育1 h以特异性识别Actin抗体，荧光显微镜下观察各组细胞形态，应用Image-Pro Plus5.0软件计算细胞面积。

1.2.5 细胞总蛋白含量检测 收集各组细胞，加入细胞裂解液制成细胞悬液，计数每孔心肌细胞数。沉淀细胞后加入150 μL NP-40溶剂细胞膜，离心取上清，用Bradford法测定细胞总蛋白含量，以BSA 0.5 mg/mL为标准品作标准曲线，计算各孔总蛋白含量。

1.2.6 细胞中AT1R、PKC蛋白表达检测 采用Western blotting法。加入细胞裂解液提取心肌细胞中的蛋白，离心取上清液，BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液，10% SDS-PAGE电泳，转膜，脱脂奶粉封闭90 min，加入一抗4 ℃孵育过夜，1×TBS液洗涤3次，加入二抗，37 ℃孵育，1×TBS液洗涤3次。ECL化学发光试剂盒显色，KODAK Image Station 4000MM图像系统曝光，分析读取条带灰度值，计算目标蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞面积比较 正常对照组、模型组和番石榴叶总黄酮低、中、高剂量组心肌细胞面积分别为(742.06±236.56)、(9 195.23±2 498.76)、(4 473.91±1 081.372)、(2 649.37±300.64)、(2 107.43±106.09)μm2。与正常对照组比较，模型组心肌细胞面积增加(P<0.01)；与模型组比较，番石榴叶总黄酮各剂量组心肌细胞面积缩小，其中高剂量组小于中、低剂量组(P均<0.01)。

2.2 各组细胞总蛋白含量比较 正常对照组、模型组和番石榴叶总黄酮低、中、高剂量组心肌细胞总蛋白含量分别为(344.31±35.46)、(677.93±36.69)、(598.51±19.38)、(521.30±24.59)、(486.39±32.12)pg/孔。与正常对照组比较，模型组心肌细胞总蛋白含量升高(P<0.05)；与模型组比较，番石榴叶总黄酮各剂量组心肌细胞总蛋白含量减少，其中高剂量组少于中、低剂量组(P均<0.05)。

2.3 各组细胞AT1R、PKC蛋白表达水平比较 与正常对照组比较，模型组AT1R、PKC蛋白表达升高(P均<0.01)；与模型组相比，番石榴叶总黄酮各剂量组AT1R、PKC蛋白表达降低，其中高剂量组低于中、低剂量组(P均<0.01)。

表1 各组心肌细胞AT1R、PKC蛋白表达水平比较

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01；与番石榴叶总黄酮高剂量组比较，△P<0.01。

3 讨论

心肌细胞肥大是以蛋白质合成增多为主要特征的生长异常，是心肌肥厚的主要病理学改变，也是引起心功能异常的重要原因。番石榴叶是我国传统中药，是桃金娘科植物番石榴的干燥叶及带叶嫩茎。其性平、味甘涩，具有收敛止泻、消炎止血的功效。番石榴叶中含有的黄酮类化合物具有抗心脑血管病、抗氧化、镇痛、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等作用。本研究结果显示，向乳鼠心肌细胞加入AngⅡ后，心肌细胞面积、心肌细胞总蛋白含量显著升高；而经番石榴叶总黄酮预处理后再加入AngⅡ，心肌细胞面积、心肌细胞总蛋白含量明显降低。表明番石榴叶总黄酮能够抑制AngⅡ导致的细胞体积增大、蛋白合成增加。

AngⅡ在心肌细胞肥大的发生发展过程中起重要作用。AngⅡ是肾素-血管紧张素系统(RAAS)中最重要的活性成分，具有直接促进心肌细胞肥大的效应以及生长因子样作用，可以在不增加血管阻力和心脏后负荷的情况下直接刺激心肌细胞蛋白质合成增加，导致心肌肥厚。AngⅡ对心肌细胞的作用主要通过AT1R介导。AT1R是一种7次跨膜的G蛋白偶联受体(GPCR)，AT1R的过度激活可导致心肌肥大及纤维化，在心肌重构过程中发挥重要作用。激活的AT1R使心肌细胞G蛋白活化并与磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C发生偶联，引起心肌细胞膜外Ca2+跨膜内流和胞质内Ca2+贮存池释放增加，并诱导细胞外信号调节激酶ERK1/2、JNK信号转导和转录激活因子、钙调节蛋白依赖性激酶Ⅱ和PKC等相关蛋白激酶的激活，继而诱导c-FOS、c-JUN等即刻早期反应基因的表达以及相关蛋白质合成的增加，最终造成心肌损伤[10，11]。

PKC是肥大信号传递中一个限速的分子开关，是肥大信号传递的共同通路之一[12～14]。PKC是钙/磷依赖的蛋白激酶，可催化各种蛋白质底物上的丝氨酸或苏氨酸残基使其磷酸化，进而控制细胞增殖；PKC自身也可以进入细胞核，是核蛋白磷酸化的重要激酶[15，16]。PKC存在于心脏组织中的所有细胞内，包括肌细胞、纤维母细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和神经元。正常情况下，PKC几乎均以无活性的形式存在于细胞质中，当受到外界刺激时，PKC以Ca2+依赖的形式从细胞质中移位到细胞膜上，此过程称之为转位。PKC向细胞膜的转位是其激活的标志[17]。PKC不仅可以转位到细胞膜上，而且可以直接进入细胞核，在细胞核内调节心肌细胞基因转录[18]。AT1R-PKC作为介导心肌细胞肥大的经典通路，备受关注。

本研究结果显示，向乳鼠心肌细胞加入AngⅡ后，心肌细胞中AT1R、PKC蛋白的表达显著升高，而经番石榴叶总黄酮预处理后再加入AngⅡ，AT1R、PKC蛋白的表达明显降低。表明番石榴叶总黄酮能够抑制由AngⅡ引起的心肌细胞AT1R、PKC表达激活。由此推测，抑制AT1R-PKC通路的表达可能是番石榴叶总黄酮抑制心肌细胞肥大的重要机制之一。

综上所述，番石榴叶总黄酮预处理能够抑制AngⅡ导致的心肌细胞肥大，其机制与抑制AT1R-PKC通路激活有关。因此，番石榴叶总黄酮可能成为抗心肌细胞肥大的新药物,明确其药理学作用可为临床治疗心肌肥厚及改善左心室重构提供新的治疗策略。