喉鳞状细胞癌组织中USP18、BTG3表达变化及与预后的相关性

朱新华,曹鹏

(泰兴市人民医院，江苏泰兴225400)

喉癌的发生发展是多步骤、多阶段的复杂过程，其机制尚未完全阐明[1，2]。泛素特异性蛋白酶18(USP18)是一种干扰素信号通路负调节器，控制着Ⅰ型和Ⅲ型干扰素通路，其高表达可促进细胞异常增殖，并影响T淋巴细胞的凋亡途径[3]。B细胞转位基因3(BTG3)是近年来发现的抗增殖基因家族成员，参与修复损伤基因、维持基因稳定等过个过程，其低表达可促进癌细胞的增殖、侵袭能力[4]。USP18、BTG3与多种肿瘤的发生发展有关[5，6]，但二者在喉鳞状细胞癌中的作用尚不明确。本研究通过检测喉鳞状细胞癌组织中USP18、BTG3的表达，并分析二者与临床病理特征、预后的相关性，旨在为临床诊疗及预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年1月～2015年7月在我院行手术切除治疗的喉鳞状细胞癌患者82例，男44例、女38例，年龄≥60岁42例、<60岁40例，肿瘤直径≥3 cm 40例、<3 cm 42例，临床分期Ⅰ～Ⅱ期44例、Ⅲ～Ⅳ期38例，声门上型24例、声门型38例、声门下型20例，分化程度高分化40例、中低分化42例，淋巴结转移45例、无淋巴结转移37例。术中另收集50例患者距肿瘤边缘1 cm以上的正常喉黏膜组织作为对照，男27例、女23例，年龄≥60岁29例、<60岁21例。患者术前均未行放、化疗，术后病理检查证实肿瘤组织为喉鳞状细胞癌、癌旁组织为正常喉黏膜组织，排除其他部位肿瘤或严重器质性病变。本研究经医院伦理委员会审核通过，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 USP18、BTG3检测方法 采用免疫组化法。收集手术切除的肿瘤组织和癌旁组织标本，加入4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切4 μm厚切片；常规脱蜡、脱水，柠檬酸高压修复；滴加相应的一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗；滴加二抗，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。以已知阳性喉鳞状细胞癌标本作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。USP18、BTG3均为细胞质和细胞核表达。随机选取5个高倍镜视野，根据阳性细胞所占比例及染色程度进行评分。阳性细胞所占比例评分：无阳性细胞为0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>76%为4分。染色程度评分：棕褐色为3分，棕黄色为2分，淡黄色为1分，无色为0分。两项评分的乘积≥2为高表达，<2为低表达。

1.3 预后观察方法 每3个月随访1次，随访内容包括是否复发、复发时间、是否死亡、死亡时间。随访截止日期为2018年8月。总生存期定义为患者术后至任何原因导致死亡的时间，无进展生存期定义为患者术后到肿瘤复发的时间，总生存率定义为随访结束时未死亡患者占总患者例数的比率，无进展生存率定义为随访结束时疾病无进展患者例数占总患者例数的比率。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存时间曲线，以Log-Rank检验进行比较。单因素及多因素回归分析采用COX比例风险模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 USP18、BTG3在喉鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中的表达比较 喉鳞状细胞癌组织中USP18、BTG3高表达率分别为37.80%(31/82)、45.12%(37/82)，癌旁正常组织分别为12.00%(6/50)、82.00%(41/50)。喉鳞状细胞癌组织中USP18高表达率高于癌旁正常组织，BTG3高表达率低于癌旁正常组织(P均<0.05)。

2.2 USP18、BTG3表达与喉鳞状细胞癌患者临床病理参数的关系 肿瘤直径≥3 cm、临床分期Ⅰ～Ⅱ期、中低分化、合并淋巴结转移患者USP18高表达率低于肿瘤直径<3 cm、临床分期Ⅲ～Ⅳ期、高分化、无淋巴结转移患者(P均<0.05)；肿瘤高分化、临床分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者BTG3高表达率高于肿瘤中低分化、临床分期Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴结转移患者(P均<0.05)。见表1。

2.3 USP18、BTG3高表达与喉鳞状细胞癌患者预后的关系 USP18低表达患者的3年总生存率为90.32%(28/31)，3年无进展生存率为80.66%(25/31)，高于USP18高表达患者的68.63%(35/51)、56.86%(29/51)(P均<0.05)。BTG3高表达患者的3年总生存率为89.19%(33/37)，3年无进展生存率为83.78%(31/37)，高于BTG3低表达患者的71.11%(32/45)、60.00%(27/45)(P均<0.05)。

2.4 影响喉鳞状细胞癌患者生存时间的单因素和多因素回归分析结果 单因素COX分析结果显示，肿瘤分化程度、肿瘤直径、临床分期、USP18高表达、BTG3低表达与患者的生存时间有关，见表2。进一步行多因素分析结果显示，肿瘤临床分期、分化程度、USP18高表达、BTG3低表达是患者生存时间的影响因素(P均<0.05)，见表3。

表1 不同临床病理参数的喉鳞状细胞癌患者USP18、BTG3高表达率比较(%)

表2 影响喉鳞状细胞癌患者生存时间的单因素COX回归分析结果

表3 影响喉鳞状细胞癌患者生存时间的多因素COX回归分析结果

3 讨论

喉癌的组织学类类型大部分为鳞状细胞癌，其具体的发病原因及机制尚未阐明[7]。BTG3是抗增殖蛋白家族易位基因成员，位于第21号染色体长臂1区1带和2区1带，是p53的下游靶标，并在p53基因毒性应激中被诱导，在多种生理病理过程中发挥作用，如细胞周期的调节、细胞分化等，其表达水平下调将导致细胞异常增殖，导致肿瘤的发生，其水平上调可阻止细胞从G0/G1期到S期。USP18是泛素系统的重要成员，具有抑制细胞凋亡、介导多种蛋白泛素化等功能。研究显示，USP18和BTG3与多种肿瘤的发生发展及转归有关[8，9]。

易礼智等[10]报道，USP18的表达水平与结直肠癌分化程度、淋巴结转移以及远处转移显著相关。布力布·吉力斯汉等[11]报道，USP18的表达状态与肿瘤的分期、浸润深度及是否淋巴结转移有关。本研究结果显示，肿瘤直径≥3 cm、临床分期Ⅰ～Ⅱ期、中低分化、合并淋巴结转移患者USP18高表达率低于肿瘤直径<3 cm、临床分期Ⅲ～Ⅳ期、高分化、无淋巴结转移患者，表明USP18高表达患者的肿瘤分化程度较低，肿瘤分期较晚，预示着这些患者的预后更差，复发和转移的可能性更大。而这些患者的肿瘤直径更小，提示这些患者出现明显临床症状的时间更晚，及时发现和明确诊断的时间更晚。USP18高表达患者更多发生淋巴结转移，同样预示USP18高表达患者的预后较差。

郑华川等[12]报道，BTG3过表达参与肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期S/G2期阻滞、分化和自噬等过程，且其表达状态与肿瘤的转移有关。吕赤等[13]报道，BTG3的表达状态与结肠癌的组织学类型及分化程度有关。本研究结果显示，肿瘤高分化、临床分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者BTG3高表达率高于肿瘤中低分化、临床分期Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴结转移患者。

研究显示，USP18和BTG3的表达状态与肿瘤患者的生存时间显著相关。本研究结果显示，USP18低表达患者的3年无进展生存期和总生存期均优于USP18高表达患者。关于USP18低表达患者预后较高表达患者更好的原因:Zheng等[14]认为，USP18表达下调可抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，并可增强化疗药物的治疗效果，从而改善这部分肿瘤患者的预后；Yawen等[15]则认为，USP18通过上调EGFR和激活AKT/SKP2途径来促进肿瘤的生长;Duex等[16]研究显示，USP18低表达可促进miR-7表达上调，miR-7反过来抑制EGFR表达和癌细胞的致瘤活性，影响患者预后;另外有研究认为，USP18可将泛蛋白样蛋白ISG15与靶蛋白解偶联，且作为Ⅰ型干扰素反应的主要负调节剂，限制由Ⅰ型IFN和药物引发的外源性凋亡途径[17]，影响抗肿瘤药物的治疗效果。

本研究结果显示，BTG3高表达患者的3年无进展生存期和总生存期均优于BTG3低表达患者。其机制可能与BTG3高表达上调细胞周期蛋白E、p16、p27、NF-κB、p38 α/β、XIAP、Bcl-2、ATG14、p53等蛋白表达，通过抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的生长和转移有关[18]。单因素和多因素COX回归分析显示，除肿瘤分期和肿瘤分化程度外，USP18高表达和BTG3低表达均为影响喉鳞状细胞癌患者生存时间的危险因素。因此，USP18和BTG3均可能成为喉鳞状细胞癌患者的治疗靶点，通过多种途径抑制或阻断两者的功能，控制病情的进展，改善患者的预后。另外，对于喉鳞状细胞癌患者，可通过检测USP18和BTG3的表达状态，对患者的预后进行评估。

综上所述，喉鳞状细胞癌组织中USP18表达升高，BTG3表达降低；USP18、BTG3表达状态与临床病理特征具有明显相关性，USP18高表达、BTG3低表达是影响喉鳞状细胞癌患者预后的危险因素。