Cripto-1 siRNA联合5-FU对大肠癌细胞增殖和迁移的影响及与EMT的关系

华丽，周燕红，游红霞

(1湖北医药学院，湖北十堰442000；2湖北科技学院)

近年来，随着饮食结构、生活习惯和环境的改变，我国大肠癌的发病率呈逐年上升的趋势，严重威胁人类健康[1]。大肠癌早期缺乏特异性表现，不易被发现，确诊时多为晚期，手术切除率低，通常采取化疗手段。5-氟尿嘧啶(5-FU)是晚期大肠癌患者化疗的首选药物[2]，但大部分患者仍死于化疗药物的不良反应和肿瘤的复发转移。如何减少化疗药物的不良反应并抑制肿瘤复发和转移，对治疗大肠癌具有重要意义。研究显示，Cripto-1是一种癌基因，参与肿瘤的侵袭与转移[3]。在上皮间质转化(EMT)进程中，由于细胞极性的改变、细胞间黏附性下降等增强了细胞侵袭运动能力，促进了肿瘤细胞向远处发生转移。研究显示，在人类大肠癌形成和肿瘤侵袭过程中伴随着EMT[4]。上皮标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)是上皮细胞表面的黏附分子，对细胞之间的黏附起重要作用；间质标志物锌指转录因子(Snail)是EMT过程中的关键转录因子。2018年3～9月，我们采用小干扰RNA(siRNA)技术沉默人大肠癌细胞中Cripto-1的表达，并联合5-FU共同作用，观察其对大肠癌细胞增殖和迁移的影响，并探讨其与EMT的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人大肠癌Lovo细胞购自中科院细胞库。5-FU(TCI公司)，RPMI1640培养基(Gibico公司)，胰蛋白酶(Gibico公司)，胎牛血清(Gibico公司)。脂质体LipofectamineTM2000转染试剂盒、Opti-MEM培养基、TRIzol试剂均购自Invitrogen公司，人工合成3对Cripto-1-siRNA和无义序列RNA(上海吉玛基因有限公司)，Transwell小室(美国BD公司)，CCK-8检测试剂盒(中国Biosharp公司)，低速离心机(德国Eppendorf公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)。鼠单抗E-cadherin(CST公司)，兔多抗snail(武汉三鹰生物技术有限公司)，兔多抗Cripto-1(Abcam公司)。

1.2 细胞培养与分组 人大肠癌Lovo细胞常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2厌氧培养箱中。待细胞贴壁80%左右即可传代，复苏后传2～3代，待细胞状态稳定后用于实验。将细胞分为正常对照组、Cripto-1 siRNA组、5-FU组、联合组。正常对照组加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养48 h。Cripto-1 siRNA组于转染前1 d取对数期生长细胞接种于6孔板，转染前用RPMI1640培养液冲洗2次；将100 μL无血清Opti-MEM培养基、8 μL LipofectamineTM2000、10 μL siRNA混匀，加入6孔板中，混匀后室温下静置25 min；转染完成后，换普通培养基继续培养48 h。5-FU组加入10 mg/L 5-FU培养48 h。联合组先按Cripto-1 siRNA组的方法进行转染，然后加入10 mg/L 5-FU继续培养48 h。

1.3 细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。取各组细胞，加入10 μL CCK-8，37 ℃培养4 h。上酶标仪，读取450 nm波长下的吸光度OD值。细胞增殖率=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(正常对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.4 细胞迁移能力观察 采用Transwell实验。取各组细胞，加入什么试剂制成细胞悬液，调整细胞密度为4×105/mL。在24孔板中预先加入600 μL含10% FBS的RPMI1640培养基，放入Transwell小室，在Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μL终浓度为300 μg/mL的Matrigel。待Matrigel干成胶状后，在Transwell上室分别接入200 μL各组细胞悬液，37 ℃、5% CO2培养箱培养过夜。取出Transwell，PBS清洗，70%冰乙醇溶液固定，0.5%结晶紫溶液染色，PBS清洗。用干净棉球擦去上室表面的细胞，倒置显微镜下观察，计数穿膜细胞数，每组观察5个视野，取平均值。

1.5 Cripto-1及EMT相关蛋白E-cadherin、Snail表达检测 采用Western blotting法。收集各组细胞，加入裂解缓冲液提取总蛋白，BCA法测定总蛋白质。10% SDS-PAGE凝胶电泳，转印于PVDF膜。封闭液(5%脱脂奶粉，0.05% Tween20，pH 7.6)室温封闭2 h。加入一抗(稀释比例1∶500)4 ℃孵育过夜，加入二抗(稀释比例1∶2 000)室温孵育2 h。TBS洗涤3次，超敏发光液曝光，X线感光片感光，显影定影。采用BandScan软件分析胶片灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH的比值表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 四组细胞增殖能力比较 正常对照组、Cripto-1 siRNA组、5-FU组、联合组的细胞增殖率分别为96.96%±2.69%、79.42%±2.46%、74.39%±4.79%、62.12%±2.80%。与正常对照组比较，其余三组细胞增殖率均降低(P均<0.05)，联合组细胞增殖率较Cripto-1 siRNA组、5-FU组降低(P均<0.05)，Cripto-1siRNA组与5-FU组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 四组细胞迁移能力比较 正常对照组、Cripto-1 siRNA组、5-FU组、联合组的穿膜细胞数分别为(185.80±4.76)、(143.60±3.36)、(128.60±4.51)、(111.60±4.28)个。与正常对照组比较，其余三组穿膜细胞数均减少(P均<0.05)，联合组穿膜细胞数较Cripto-1 siRNA组、5-FU组减少(P均<0.05)，5-FU组较Cripto-1 siRNA组减少(P<0.05)。

2.3 四组Cripto-1、E-cadherin、Snail蛋白相对表达量比较 Cripto-1 siRNA组、5-FU组、联合组Cripto-1和Snail蛋白表达低于正常对照组，E-cadherin蛋白表达高于正常对照组(P均<0.05)；联合组Cripto-1和Snail蛋白表达低于Cripto-1 siRNA组、5-FU组，E-cadherin蛋白表达高于Cripto-1 siRNA组、5-FU组(P均<0.05)；Cripto-1 siRNA组与5-FU组各蛋白表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 四组Cripto-1、E-cadherin、Snail蛋白相对表达量比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与联合组比较，#P<0.05。

3 讨论

大肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率居全球第3位[5]。5-FU为细胞周期特异性药物[6]，是大肠癌的标准辅助化疗的基础药，其通过抑制嘧啶类核苷酸合成，抑制癌细胞DNA、RNA的合成，从而诱导细胞凋亡。5-FU治疗大肠癌的单药有效率约为20%，但其不良反应较多[7]，如恶心、呕吐、腹泻、口腔黏膜炎等，严重者会出现白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少，且长期应用导致耐药性增加，因此其临床应用受到限制。从基因角度出发，干扰癌基因表达可减少化疗药物的用量，进而减少药物不良反应，是一种新型治疗方法。Cripto-1是一种癌基因，在肿瘤的发生、侵袭和转移过程中起重要作用[3]。在食管癌、胃癌、宫颈癌等研究中发现，Cripto-1可以通过EMT促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[8～10]。文献报道，Cripto-1在人结肠癌组织中高表达，在大肠癌患者血液中水平增高[11]，但其是否参与了大肠癌细胞的侵袭转移鲜见报道。

肿瘤的发生与肿瘤细胞的恶性增殖密切相关，抑制肿瘤细胞增殖是治疗肿瘤的有效手段。本研究结果显示，干扰组、5-FU组、联合组增殖率明显低于对照组，其中联合组的增殖抑制率最低。表明干扰Cripto-1表达可抑制大肠癌Lovo细胞增殖，可能是大肠癌治疗靶点，与5-FU联用可更好地抑制大肠癌细胞的增殖，为大肠癌的化疗提供了新的方法。

恶性肿瘤主要生物学特征是侵袭和转移[12]，也是肿瘤患者死亡的重要原因，抑制肿瘤的侵袭和转移是治疗的关键问题。本研究结果显示，与正常对照组比较，Cripto-1 siRNA组、5-FU组、联合组的穿膜细胞数均减少，其中联合组最少。提示Cripto-1基因可促进大肠癌细胞的侵袭与转移，靶向沉默Cripto-1表达能抑制大肠癌细胞的迁移能力；5-FU可以抑制大肠癌细胞的侵袭和转移，靶向沉默Cripto-1表达联合5-FU能够更好地抑制大肠癌细胞的侵袭转移。

EMT在肿瘤的浸润与转移过程中具有重要作用[13，14]。EMT在演变过程中伴随着上皮黏附分子(如E-cadherin、β-catenin)的表达缺失或下调以及间质标志物(如Snail、Vimentin等)的表达或上调。E-cadherin是上皮细胞表面的黏附分子，对细胞之间的黏附起重要作用，其表达下调使细胞之间黏附能力下降，转移侵袭能力增强[15]。Snail是EMT过程中的关键转录因子[16]，其通过与E-cadherin的启动子区E-box结构结合，抑制E-cadherin的转录表达，导致细胞彼此之间的黏附力降低，诱导EMT的发生，促进肿瘤细胞浸润和转移。本研究结果显示，与正常对照组比较，Snail蛋白表达下调，其中Cripto-1 siRNA联合5-FU组Snail蛋白表达受到显著抑制，而E-cadherin蛋白的表达则完全相反。说明Cripto-1基因可能通过调控EMT促进大肠癌细胞的侵袭与转移。既往研究表明，EMT介导肿瘤的侵袭转移与转化生长因子β、表皮生长因子、肝细胞生长因子、Wnt信号通路及Notch信号通路等多条信号通路相关[3]，Cripto-1通过何种信号通路介导EMT仍需进一步研究。

本研究结果显示，5-FU也可下调Cripto-1蛋白表达，说明5-FU也可能通过抑制Cripto-1信号通路而抑制大肠癌细胞的侵袭转移。与正常对照组、5-FU组及Cripto-1 siRNA 组比较，联合组Cripto-1蛋白表达降低，穿膜细胞数量减少，提示Cripto-1 siRNA与5-FU可能存在协同作用，降低了大肠癌细胞的侵袭转移能力。

综上所述，Cripto-1基因可促进大肠癌细胞的增殖与迁移，RNA干扰靶向抑制Cripto-1表达联合5-FU可抑制大肠癌细胞的增殖与迁移，从基因角度为大肠癌的侵袭转移机制及化疗提供了新的思路，但其侵袭转移的机制尚未明确，需进一步深入研究。