基于SSR荧光标记的白蜡核心种质构建

燕丽萍，吴德军，毛秀红，姚俊修，任 飞，李善文，王开芳，王因花，刘翠兰

（1.山东省林业科学研究院，山东 济南 250014；2.山东省林木遗传改良重点实验室，山东 济南 250014）

白蜡属Fraxinus隶属木犀科Oleceae 木樨亚科[1]。白蜡属植物全世界约70余种，我国有30多种，品种繁多，种质资源非常丰富[2-3]。据崔铁成报道，西安植物园收集保存了陕西白蜡树属植物资源标本300 余号，共10 个种[4]。据国家林木种质资源平台统计，中国林科院林研所、黑龙江林业科学研究院等单位在黑龙江省林口青山水曲柳保存库共保存水曲柳家系428份，辽宁省本溪市恒仁县保护区水曲柳种子园共收集保存野生资源（群体）130份左右，辽宁省鞍山市岫岩县清凉山林场收集保存水曲柳无性系70 个左右。湖北省林木种苗管理总站收集选育了湖北白蜡无性系10 余个，其他单位也相继收集保存了美国白蜡、小叶白蜡等树种的种质资源。山东省林业科学研究院历经30 余年的调查，收集保存绒毛白蜡等种质资源300 余份，建立了国家白蜡良种基地。这些宝贵的种质资源为白蜡属植物遗传改良和创新利用提供了大量的资料，丰富的种质资源使育种目标更具有可行性和可靠性，然而庞大的种质资源数量又给保存及评价鉴定带来了困难[5]。因此，构建核心种质，充分利用现有白蜡种质资源遗传多样性就显得十分重要。

Frankel 首次提出核心种质这一概念[6]，核心种质是以最小样本种质资源的数量能够最大程度地代表整个种质资源样本的遗传多样性，继续深入的挖掘优异基因核心资源，能够有效提高种质资源的利用价值和效率。近年来构建核心种质已成为林木种质资源国际研究的热点[7-8]，自从1994年国际上提出构建核心种质，已经在很多农作物上构建了核心种质，如小麦Triticum aestivum[9]、蚕豆Vicia faba[10]、水稻Oryza sativa[11]和扁豆Lablab purpureus[12]。而林木核心种质仅对木荷Schima superba[13]、楸树Catalpa bungei[14]、银杏Ginkgo biloba[15]和欧洲黑杨Populus nigra[16]等树种进行了初步研究。林木大多数为多年生木本植物，保存方式主要以原地保存和异地保存为主，占地面积大，管理经费高，建立林木核心种质是十分必要和迫切的。核心种质的构建为种质资源的有效保护和深入评价开辟了新途径。本课题选用SSR标记对我国不同地区的白蜡资源进行遗传多样性研究，目的在于对白蜡属植物核心种质进行构建，并初步验证核心种质资源的代表性，为白蜡种质资源的收集、保存和核心材料的有效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为2013年在甘肃、陕西、新疆等8个省市自治区收集的资源，于2014年春天嫁接保存山东省林业科学研究院寿光试验站（37°16′N，118°58′E，面 积 为180 hm2，年均气温13.2 ℃，年均降水量708.4 mm）。取样种质为山东12 个地区（158份） 、北京（16份） 、陕西4 个地区（15份） 、新疆（6份）、甘肃（3份）、湖南（2份）、河北（1份）和黑龙江（1份）8 个省（市） 22 个地区的202份白蜡种质资源，包括14 个种，其中绒毛白蜡Fraxinus velutina96份，中国白蜡Fraxinus chinensis25份，花曲柳Fraxinus rhynchophylla20份，美国红梣Fraxinus pennsylvanica18份，欧洲白蜡Fraxinus excelsior11份，美国白蜡Fraxinus americana8份，窄叶白 蜡Fraxinus baroniana4份，秦岭梣Fraxinus platypoda4份，新疆小叶白蜡Fraxinus sogdiana3份，象蜡树Fraxinus platypoda3份，水曲柳Fraxinus mandschurica3份，狭叶白蜡Fraxinus angustifolia3份，对节白蜡Fraxinus hupehensis3份，庐山白蜡Fraxinus sieboldiana1份（表1）。于2016年8月取生长健壮、无病虫害的单株新鲜幼叶2～3 个，液氮速冻带回实验室，-80℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA 的提取

基因组DNA 提取采用CTAB 法，提取缓冲液中加入2%β-巯基乙醇和2%PVP，并稍做改进[17]。紫外分光光度法测定DNA 的浓度和纯度，稀释至30 ng·μL-1，保存-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 SSR 引物筛选和PCR 扩增

选取表型性状差异较大的4 个白蜡品种华雄、鲁蜡5 号、金叶白蜡和金枝白蜡提取DNA 进行SSR 引物筛选，所用引物课题组通过转录组测序开发获得，初步筛选500 对SSR 引物作为本研究的候选引物，由山东沃恩科技有限公司合成。PCR 反应体系：引物正反向引物各0.3 μL（10 μmol·L-1）、DNA 模板0.2 μL-1、PCR-Mix 5.5 μL、ddH2O 3.7 μL共计10 μL。PCR 反应条件：94 ℃ 预变性3 min，94 ℃变性1 min，54～58 ℃退火1 min，72 ℃延伸l min，共35 个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃10 min 终止反应。SSR 扩增产物在8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，扩增产物点样3.5 μL，分子量标准为50 bp DNA Ladder，在200 V 电压下预电泳30 min，再继续电泳2 h，用0.1%的AgNO3溶液银染，漂洗，NaOH 溶液显色，凝胶扫描保存，统计数据后进行分析，具体步骤参考赵梁军等的专利技术（ZL 201410318921.X,2015.9）[18]。最终从500 对引物中筛选出扩增带型清晰、主带明显、稳定、多态性、重复性好的42对高效SSR 引物标记。

表1 白蜡种质资源Table1 Fraxinus germplasm resources

续表1Continuation of table 1

1.2.3 SSR 荧光标记毛细管电泳

从42 对引物中筛选出多态性好的17 对引物（表1），在每对引物5′端添加荧光标记FAM（6-carboxy-fluorescein）。正向引物为与携带荧光标记的TP-M13 引物组成，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。荧光标记毛细管电泳的PCR扩增采用10 μL 的反应体系：DNA 模板1 μL-1、2X Taq plus PCR Master Mix 5 μL、正反向引物各0.1 μL（10 μmol·L-1）以及 ddH2O 共10 μL。PCR 扩增程序采用Touchdown 模式：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s（每个循环降低0.5℃），72℃延伸30 s ，15 个循环；95 ℃变性30 s ，50 ℃退火30 s ，72 ℃延伸30 s，20 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR产物0.3 μL、GS-500LIZ 分子量内标0.5 μL 和去离子甲酰胺9.5 μL 混合加入PCR 板，95℃变性5 min，4 ℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测。采用3730 xl DNA 测序仪进行毛细管电泳：预电泳15 kV 下3 min；1.6 kV 下进样15 s；电泳15 kV下20 min。将上机结果原始文件导入Genemarker 2.2.0 软件，进行数据收集和图像分析。

1.2.4 数据分析

根据筛选引物时确定的分子量大小及引物颜色进行分子量的确定，将收集的原始数据采用Data Collection 软件导入Gene Marker 2.2.0 系统进行分析[19]。根据目标峰值大小系统软件与其泳道中的GS-500LIZ 分子量内标进行比较，准确计算出目标DNA 片段大小，将电泳结果转化成PDF图片格式导出。各荧光标记毛细管电泳检测3 次重复，3 次重复的平均值作为实验材料在该座位上的数据。

1.2.5 核心种质构建

基于SSR 多样性计算的期望杂合度，根据每个白蜡样品对总体遗传多样性的贡献程度，对所有白蜡样品进行了排序。具体方法通过R 语言包Genetic Subsetter 实现[20]，该算法已被成功用于美国农业部大麦核心种质的构建。样本数量占总数量的20%和40%，分别构成核心种质的样本群。核心种质和初始种质资源的有效等位基因数、Shannon’s 多样性信息指数、遗传多样性等指标进行t检验，评价核心种质代表性的数量。

2 结果与分析

2.1 荧光标记SSR 多态性引物筛选

利用8%非变性聚丙烯酰胺凝上电泳初步筛选出的42 对多态性引物（图1），采用42 对引物对4 个白蜡品种进行荧光标记毛细管电泳检测，结果发现由聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的部分引物，添加荧光标记后采用毛细管电泳方法检测不到稳定的片段，因此根据荧光PCR 检测排除较多峰型异常和位点不易辨别的引物（图2），最终筛选出分辨率高、稳定性高和多态性高的17 对引物（表2）。

2.2 202份白蜡属种质SSR 遗传多样性分析

图1 引物147 在46份白蜡中的扩增结果Fig.1 DNA fragments amplified by SSR primer 147 in 46 Fraxinus

图2 引物202 在不同白蜡品种间扩增产物的带型Fig.2 Amplification bands between different genotypes of Fraxinus using primer 202

表2 17对SSR荧光引物信息Table2 Information of 17 SSR fluorescence primer pairs

表3结果可见，17 对SSR 引物扩增共检测出142 个等位基因（Na），不同引物扩增可检测到有效等位基因数为2（S217）～15（S203）个，每对引物的等位基因数明显不同，平均每对引物等位基因数为8.353 个；有效等位基因（Ne）数范围为1.503（S112）～5.260（S202）个，平均每对引物3.342 个。PIC 变动范围为0.315（S112）～0.783（S202），平均0.635，表明白蜡品种间变异较大，具有丰富的遗传多样性。Shannon 指数变化范围为0.705（S112）～1.877（S202），均值为1.393；观测杂合度Ho指数变化范围为0.168（S208）～0.980（S123），平均为0.557；期望杂合度He指数变化范围为0.335（S112）～0.810（S202），平均为0.677。综上所述，可得出S202、S203、S186 这3 对引物是17 对引物中鉴定效率最高的引物，今后在白蜡DNA 指纹数据库的构建及品种鉴定中重点应用。

表3 白蜡202份种质资源遗传多样性分析Table3 The genetic diversity parameters of Fraxinus germplasm resources

2.3 核心种质的构建与评价

通过R 语言包Genetic Subsetter 对白蜡样品的排序结果，按照原始种质构建了20%候选核心种质。由表4可知，通过对遗传多样性指数的分析，并与原始种质比较显示，原始样本和初步构建的核心种质样本遗传特性极其相近。遗传多样性的保留率等位基因数Na、有效等位基因数Ne、观测杂合度Ho、Shannon 信息指数I、期望杂合度He及多态信息指数PIC 分别为180.3%、106.2%、107.0%、107.8%、105.6%和101.7%。

利用SAS 软件对构建的不同核心种质遗传多样性参数进行t检验，表4结果显示各遗传多样性参数与原始种质差异不显著，因此选择样品数量最少的20%为核心种质，即40份种质编号（与表1一致）分别为2、7、13、15、16、18、25、41、42、43、50、51、54、55、56、58、60、61、63、64、73、74、77、84、87、95、105、116、124、141、146、147、156、159、164、175、176、191、193 和197。表明构建的核心种质进行了有效的选取，能够很好的保存了原始种质资源的遗传多样性，又可以利用最少的白蜡核心种质能够充分代表原始种质资源最大的遗传多样性。

表4 供试白蜡种质的初级核心样品及核心种质的遗传多样性比较Table4 Comparisons of genetic diversity of the primary core samples and core collection of Fraxinus cultivars

黑龙江、北京、湖南长沙及新疆乌鲁木齐4个地区的核心种质资源数分别占该地区原始种质资源数的100%、56.3%、50% 及50%，均远高于20%，说明这4 个地区的白蜡资源遗传多样性的丰富度远高于原始种质（表5）。反之也可以说明，甘肃天水、河北石家庄、山东菏泽、山东济宁、山东临沂和陕西杨凌6 个地区的遗传多样性很低。

表5 各地区的核心种质数及其占该地区原始种质数的比例Table5 Ratios of core collection from each original germplasms

3 结论与讨论

3.1 讨 论

3.1.1 白蜡种质遗传多样性

解决育种和种质资源管理方面的问题，研究其物种的遗传多样性和种质间的亲缘关系具有非常重要的意义[21-23]。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR 技术对白蜡种质SSR 反应体系优化和遗传多样性前人已有研究报道，平均每对引物能检测到3.5 个多态位点，多态性信息含量（PIC）平均为0.548 0[24-25]，但是使用荧光标记毛细管电泳检测SSR 标记的方法，构建白蜡属植物种质资源的遗传多样性分析还鲜见报道。本研究遴选了17 对引物对202份白蜡属植物种质资源进行遗传多样性分析，所有引物均表现出较好的多态性，这一结果高于前人的研究结果。本研究中有效等位基因（Ne）数范围为1.503（S112）～5.260（S202）个，平均每对引物3.342 个。PIC 变动范围为0.315（S112）～0.783（S202），平均0.635，表明白蜡品种间变异较大，具有丰富的遗传多样性，这也说明荧光标记毛细管电泳检测SSR 标记技术非常适用于白蜡亲缘关系的研究。

3.1.2 白蜡核心种质的构建

前人主要采用形态标记和分子标记2 类方法构建核心种质[26]。利用分子标记来构建核心种质是准确而有效的方法，这种方法已经广泛应用于许多种质资源的研究中[27-28]。衡量构建核心种质的重要因子是样本量的大小和取样方法，核心种质代表整个遗传资源的最大的遗传多样性[29]。核心种质取样比例应根据不同物种特性的遗传多样性和遗传结构而定[30]。因此，本研究利用17 对多态性SSR 引物，根据白蜡样品对总体遗传多样性的贡献程度，进行了排序，构建白蜡属植物的核心种质，该研究方法已在许多研究中报到[31-32]。

从目前发表的相关文献可以看出，国内外研究中所构建的不同植物核心种质其所占比例大多数在5%～40%[33-34]。Liang 等利用SSR 标记获得了55份苹果Malus domestica核心种质，占分析种质的13.2%[35]。王萱等分析了180份银杏Ginkgo biloba古树的遗传多样性，获得了63份核心种质占35%[36]。这些结果均表明取样比例的大小应视种质资源的种群数量和遗传多样性来确定。在本研究中，在原始202份白蜡种质的基础上，逐步构建了60%、40%和20%不同比例的核心种质，通过3 种不同取样的方式比较白蜡属植物的核心种质，最终选取20%的比例作为构建的核心种质，能够很好地代表整个白蜡属植物资源的遗传变异。选出的40份核心种质涵盖了来自中国22 个省（区），表3结果发现各遗传参数与原始种质差异不显著，因此，所构建的核心种质能够充分代表原始种质资源的遗传多样性。

3.2 结 论

本研究从42 对SSR 引物中筛选出17 对扩增稳定的荧光标记引物，采用毛细管法研究了来自全国22 个地区的具有代表性的202份白蜡种质资源的遗传多样性，共检测出142 个等位变异，平均每对引物等位基因（Na）数为8.353 个；平均有效等位基因数（Ne）为3.342；平均多态性信息含量（PIC）为0.635 2，白蜡属植物种间变异较大，具有丰富的遗传多样性，建立基于高通量荧光SSR标记的白蜡种质鉴定体系。并首次构建了白蜡属植物的40份核心种质，对白蜡属植物种质资源的保护、管理和利用提供了理论依据和种质材料。