响应面优化药食同源基质制曲工艺及酒体成分分析

禹晓婷，苏 伟*，齐 琦，姜 丽

（1.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

中国酒曲历史悠久，品种多样，酒曲的种类及品质决定着酒体的风格、香味物质以及营养成分的组成，因此有“曲乃酒之骨”和“好曲出好酒”的说法[1-3]，而药曲则是指制曲时加入中药材。中药材在传统药曲制作中有长期和广泛的应用。制曲添加中药材，一方面可以抑制杂菌、促进有益微生物的生长代谢；另一方面也赋予发酵食品一定的风味，还有一个重要目的是开发保健功效[4]。在《齐民要术·河东神曲方》、《白醪曲》、《北山酒经》和《苏轼·酒经》中均有用药制曲的记载，因此有“无药不成曲”的说法[5-7]。赵申升[8]、罗歆[9]、李新社[10]等均在制曲时加入一定比例的中药材，得到了糖化能力和液化能力较高的中药曲。在越南，人们添加肉豆蔻皮、甘草根、细辛、白豆蔻果、茴香和丁香等制曲，主要目的是加强香气，抑制有害微生物的生长[11]。

传统酒曲制作大多是以麸皮或者谷物为基质，不添加任何外加基质，通过自然接种微生物，所制得酒曲微生物种类繁多，品质参差不齐，加上工艺落后，生产环境差，设备简陋，造成在米酒发酵过程中常常伴有杂菌污染，使米酒品质不稳定，因此Yu等[12]利用分离的米曲霉CJCM-4对米曲的制备进行优化。根霉是小曲的最主要糖化菌[13]，对发酵酒乙醇、高级醇含量等都有显著影响，同时还具备产多种脂及多种有机酸的能力，对米酒的质量和风味有重要影响[14-15]。本研究采用纯种根霉和酵母接种到药食同源基质制曲，既可以避免发酵过程中杂菌污染严重的问题，又可以通过新基质赋予酒体丰满风味，同时增加保健功效，赵婷婷等[16]利用1 株产香酵母协同米根霉发酵，生产出滋味丰富的米酒。

本研究以枸杞、覆盆子、山药、酸枣仁、芡实、沙棘、干姜、甘草、桑葚、人参、牛蒡根和玛卡12 味药食同源的物质作为制曲基质，该12 味中药材有滋阴补肾、开胃健脾、通达气血等作用。通过将其制成酒曲，在微生物作用下使药材中的有效成分充分释放，并随着发酵进入酒体，以期达到增加米酒营养成分的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

各药材质量分数：玛卡33.5%、人参6.7%、酸枣仁3.3%、牛蒡根6.7%、甘草3.3%、干姜3.3%、芡实6.7%、山药6.7%、桑葚子2.0%、覆盆子4.5%、枸杞20.0%、沙棘3.3%。以上药材均为市购，粉碎混合后干燥，密封备用（工厂已粉碎完成）。

Z-20根霉曲（传统曲） 四川泸州市酿酒科学研究所；增香酵母 贵州轻工酿酒研究所；三氯甲烷美国天地公司；愈创木酚、4-乙基愈创木酚、对乙基苯酚、苯酚、2-甲酚 德国DR公司；28 种标准物质和内标物乙酸丁酯 国家标准物质中心；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Trace GC Ultra-DSQ MS气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪、固相萃取C18柱（1 000 mg/6 mL） 美国赛默飞世尔公司；FA2004N电子天平 上海菁海仪器有限公司；DHP-420型电热恒温培养箱 天津天泰仪器有限公司；HHS6型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；DK-98-II型电子调温万用炉 天津市泰斯特仪器有限公司；MB90型水分测定仪 奥豪斯仪器（常州）有限公司；L5S紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料预处理

市购当年生长药材，洗净挑出杂质，干燥并粉碎，干燥后药材自身含水量在10%～13%为最佳，密封备用。

1.3.2 制曲工艺流程及操作要点

1.3.2.1 制曲工艺流程

取粉碎后药材润料0.5 h→蒸煮上汽10 min→迅速降温并打撒→装入三角瓶→接种根霉和酵母→三角瓶恒温培曲→扣瓶1 次（24 h左右）→出曲低温烘干→密封保藏

1.3.2.2 制曲操作要点

选用品质上佳的各药食同源药材并粉碎，混合均匀。润料，控制含水量，浸润药材30 min，上锅蒸煮至上汽，10 min后取出迅速打散并降温至25～30 ℃装入灭菌三角瓶。根据药材质量接入根霉与酵母，混合均匀。三角瓶恒温培养24 h左右瓶内布满菌丝，菌丝联结基质成块后翻曲。再经12 h左右生长完成。取出实验曲于在低于40 ℃培养箱中逐步升温干燥。若出现黑灰色孢子，则说明基质水分过高，应减少润料水分。

1.3.3 最佳酵母接种量的选择

接种酵母是为充分分解药材中的蛋白质，降低米酒中沉淀物质，同时增加米酒中氨基酸含量[17]。酵母能够以乙醇为碳源，具备乙醇发酵能力和醋酸发酵能力，能产生以酯香为主的多种香味物质[18]，在根霉接种量0.3%、培曲时间40 h、基质含水量65%和培曲温度28 ℃条件下，选择酵母接种量为药材干质量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，以曲液化酶活力为指标，选择最佳酵母添加量。

1.3.4 单因素试验

固定根霉接种量0.3%、培曲时间40 h、基质含水量65%和培曲温度28 ℃为单因素试验条件，以糖化酶、液化酶活力值为评价指标，选择根霉接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，以药材干质量计）、培曲时间（32、36、40、44、48 h）、基质含水量（55%、60%、65%、70%、75%）、培曲温度（26、28、30、32、34 ℃）4 个因素进行单因素试验，考察各因素对产酶能力的影响。

1.3.5 制曲工艺响应面优化试验

在单因素试验的基础上，以基质含水量、根霉接种量、培曲时间和培曲温度4 个因素为自变量，以糖化酶活力为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理进行4因素3水平试验设计，并进行数据拟合优化制曲工艺[19-20]，试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.6 实验曲指标测定

含水量的测定：采用干燥法[21]；糖化酶、液化酶活力测定：采用文献[22]方法；蛋白酶活力测定：采用SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》方法；纤维素酶测定：采用二硝基水杨酸法[23]；果胶酶测定：采用分光光度法[24]；脂肪酶活力测定：参考GB/T 23535—2009《粮食、油料的脂肪酶活动度的测定》方法。

1.3.7 米酒挥发性成分的测定

米酒挥发性成分测定具体方法参照文献[25-27]。

1.4 数据处理

采用Design-Expert V8.0.6响应面设计软件Origin 8.0和IBM SPSS Statistics 25进行数据处理，结果以 ±s表示。

2 结果与分析

2.1 酵母最佳接种量的确定

由图1可知，当酵母添加量为1.5%时，曲液化酶活力达到最大值（1.32±0.032）g/（g·h），此时α-淀粉酶将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖和葡萄糖，发酵液浓度和黏度降低。酵母添加量过少，导致药材中有机物利用率低，酵母聚集生长差；酵母添加量过多，酵母生长所需要营养物质不足，同样会导致液化酶活力降低。因此酵母添加量1.5%是实验曲制作的最佳接种量。

图1 酵母添加量对液化酶活力的影响Fig. 1 Effect of yeast inoculum amount on liquefaction enzyme activity

2.2 单因素试验结果

2.2.1 根霉接种量对酶活力的影响

图2 根霉接种量对糖化酶、液化酶活力的影响Fig. 2 Effects of Rhizopus inoculum size on liquefaction enzyme and glucoamylase activity

由图2可知，接种量在0.1%～0.5%范围内变化时，糖化酶、液化酶活力呈先上升后快速下降的趋势。当接种量为0.3%时，酶活力最高，随着接种量继续增大，酶活力开始逐渐降低。这是因为当接种量较大时，根霉将基质营养物质都用来自身生长，使生长发育加快，导致较早进入衰老期，不利于酶等代谢产物的合成分泌[28]。合适的接种量有利于在较短的时间内产生更多高活性的糖化酶。因此，设计响应面试验时选用根霉接种量0.2%、0.3%、0.4%。

2.2.2 培曲时间对酶活力的影响

由图3可知，当培养时间在32～48 h时，糖化酶、液化酶活力随培养时间增加呈先上升后下降的趋势，在40 h时酶活力最大，32～36 h酶活力增加幅度小的原因是根霉生长处于迟缓期，菌体摄取营养物质主要用于自身细胞质生长，酶分泌较少。当进入菌丝体快速生长阶段，产生大量代谢产物，随着菌体大量生长代谢，基质中营养物质被消耗，菌体生长缓慢，逐渐进入衰亡期，代谢物逐渐变少[29]，因此酶活力降低。传统的培曲时间一般较长，一般为几天到几十天不等[1]，本研究仅用40 h左右便使酒曲达到相同效果的酶活力，说明添加中药对酵母和根霉生长产酶均有积极作用。因此，选培养时间为36、40、44 h设计响应面试验。

图3 培曲时间对根霉糖化酶、液化酶活力的影响Fig. 3 Effect of cultivation time on liquefaction enzyme and glucoamylase activity

2.2.3 基质含水量对酶活力的影响

图4 基质含水量对根霉糖化酶、液化酶活力的影响Fig. 4 Effect of matrix moisture contents on liquefaction enzyme and glucoamylase activity

由图4可知，当药材含水量在55%～75%之间时，糖化酶、液化酶活力均呈现先增加后降低的趋势，当基质含水量在65%时，酶活力最大。根霉属好湿型微生物，喜欢生长在潮湿的环境，因此水分的改变对根霉在麸皮中的繁殖有很大影响。当基质含水量低时，根霉水分短缺，菌体繁殖渐次变慢至停止；增大基质含水量，根霉生长虽快，但基质聚集成团，基质内菌体通过无氧呼吸产乙醇而妨碍根霉菌丝的连续繁殖，基质中出现灰黑孢子, 有异味等问题，降低了糖化酶活力。因此，选择基质含水量为60%、65%、70%进行响应面设计。

2.2.4 培曲温度对酶活力的影响

由图5可以看出，当培曲温度在26～34 ℃时，糖化酶、液化酶活力均呈先增高后降低的趋势，当培曲温度在28 ℃时，酶活力均达到最大。温度主要是通过影响微生物体内的核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能影响微生物生长、繁殖以及新陈代谢。过高的环境温度会导致部分生物大分子变性失活，而过低的温度会使酶活力钝化，细胞的新陈代谢活动减弱。因此，选择培曲温度为26、28、30 ℃。

图5 培曲温度对根霉糖化酶、液化酶活力的影响Fig. 5 Effect of culture temperature on liquefaction enzyme and glucoamylase activity

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计与结果

以霉菌接种量、培曲时间、基质含水量、培曲温度为因素，糖化酶活力为响应值进行制曲优化试验。响应面Box-Behnken试验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design with experiment and predicted values of glucoamylase activity

2.3.2 模型方差分析及响应面分析

表3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

从表3可看出，模型极显著，失拟项不显著，说明该回归模型预测值与实测值有较好的拟合水平，该模型适用于对中药制曲工艺进行分析和预测。回归系数R2为0.983 5，表明该模型相关度好。=0.967 0，表明有96.7%的响应值变化可以用模型来解释，模型具有良好的拟合度，试验误差较小，可以对结果进行准确分析和预测。回归方程中各变量对指标（响应值）影响的显著性，由F检验判定，结果表明：D、CD、A2、B2、C2、D2达到极显著水平，AB达到显著水平。仅考虑显著项，得到的二次多元回归方程为：糖化酶活力=776.87－7.70A－0.33B＋9.39C＋30.31D＋19.58AB＋1.50AC＋4.50BC＋3.75BD－28.67CD－104.03A2－106.40B2－107.91C2－145.11D2。回归方程一次项系数绝对值的大小，决定了各因素对响应值影响的主次顺序，所以各因素对响应值影响排序为：培曲温度＞基质含水量＞根霉接种量＞培曲时间。

2.3.3 响应面分析与条件优化

等高线图可以直观地反映两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形与之相反[30]。根据回归方程绘制响应面见图6。

图6 各因素交互作用对曲糖化酶活力的响应面和等高线图Fig. 6 Response surface and contour plots showing interactive effects of various factors on glucoamylase activity

从图6a可以看出，基质含水量65%、培曲温度28 ℃时，霉菌接种量和培曲时间交互作用显著。从三维立体图可以看出，增大根霉接种量和培曲时间有利于糖化酶活力的提高，糖化酶活力在极大值点。当培曲时间保持不变时，随着根霉接种量增加，糖化酶活力先增高后降低，但不管培曲时间较长还是较短，糖化酶活力升高和降低的幅度较一致；当保持根霉接种量不变时，随着培曲时间增加，糖化酶活力也呈先增加后降低的趋势。由等高线图可知，根霉接种量对糖化酶活力的影响比培曲时间要大，这与方差分析结果一致。当培曲时间在37.96～41.94 h，根霉接种量在0.25%～0.35%时，对糖化酶活力提高最为有利。

从图6b可以看出，当根霉接种量0.3%、培曲时间40 h时，培曲温度和基质含水量交互作用显著。从三维立体图可以看出，响应面坡度较大较为陡峭，这说明糖化酶活力对培曲温度和基质含水量改变有较高的敏感度。当培曲温度和基质含水量分别保持不变时，随着基质含水量和培曲温度的分别增加，糖化酶活力均呈现出急剧增加后又急剧降低的趋势，由等高线图可知，培曲温度对糖化酶活力的影响比基质含水量大，与方差分析结果一致。当基质含水量在60.90%～69.5%，培曲温度在26.75 ～29.67 ℃时，对糖化酶活力的提高最有利。

利用Design-Expert 8.0.6软件进行最佳工艺参数组合，优化结果为：根霉接种量0.3%、培曲时间39.99 h、基质含水量65.15%和培曲温度28.20 ℃，在此条件下曲糖化酶活力预测值为778.65 mg/（g·h）。考虑到实际操作情况，将各条件修正到根霉接种量0.3%、培曲时间40 h、基质含水量65%和培曲温度28 ℃，在该条件下进行3 次实验，得到的结果平均值为（779.233±0.577）mg/（g·h），与预测值接近，说明该模型很好地预测了曲的糖化酶活力，优化工艺条件可靠。

2.4 酶系分析结果

采用最佳优化方案制曲与传统曲进行糖化酶、液化酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶以及脂肪酶活力分析比较，见表4。

表4 酒曲酶系分析比较Table 4 Comparison of multi-enzyme analysis of new and traditional koji

由表4可知，实验曲和传统曲之间同种酶其酶活力也可能存在显著性差异。实验曲的糖化酶、液化酶活力较传统曲有明显提高，糖化酶活力为（779.233±0.577）mg/（g·h），约是传统曲的1.3 倍，液化酶活力为（2.730±0.231）g/（g·h），约为传统曲的2.8 倍，差异极显著（P＜0.001），这说明实验曲具有明显强化酒发酵的能力，对根霉和酵母的生长有促进作用。实验曲的蛋白酶活力较传统曲高，酸性和中性蛋白酶存在极显著差异（P＜0.001），碱性蛋白酶差异显著（P=0.027），这可以解决酿酒过程中蛋白质分解不完全，出现沉淀等问题，同时也可增加酒酿中氨基酸含量。实验曲的酸性纤维素酶活力约为传统曲酶活力的1.6 倍，说明药材中的某些物质可以促进微生物生长，同时促进微生物分泌纤维素酶[31]。两种曲果胶酶活力分别为（260.730±3.300）U/g和（235.427±3.810）U/g，酶活力相差不大。纤维素酶可降解发酵原料中的纤维素，果胶酶能够分解酒曲原料中果胶物质生成甲醇和聚半乳糖醛酸，两者都能够提高原料的利用率[32]。实验曲脂肪酶活力（（18.888±3.849）U/g）较传统曲（（15.555±1.924）U/g）高，说明实验曲能够更好的将原料中的脂肪类物质转化为脂肪酸、甘油二酯等物质，可以更好地为酒体中的香气成分做贡献。

2.5 酒曲酿酒GC-MS挥发性成分分析

图7 实验曲酿造米酒中挥发性成分GC-MS总离子流图Fig. 7 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in new rice mwine

图8 传统曲酿造米酒中挥发性成分GC-MS总离子流图Fig. 8 GC-MS total ion current chromatogram of volatile components in traditional rice wine

表5 米酒挥发性成分分析结果Table 5 Volatile component analysis results of rice wines

实验曲酿造米酒和传统曲酿造米酒GC-MS总离子图见图7和图8，鉴定的香气物质见表5，共检测了33 种成分，其中醇类7 种、酯类8 种、酸类10 种、醛类3 种、酚类5 种。实验曲酿造米酒中醇类物质含量均高于传统酿造米酒，特别是异戊醇、正乙醇质量浓度高达（109.394±14.474）μg/100 mL和（100.364±24.177）μg/100 mL，是传统曲酿造米酒的11 倍和14.5 倍，这使得米酒的果香味与清香味大大增加。醇类是酒体呈香的主体成分，少量的高级醇能赋予酒体高雅的水果香，同时还是形成酯类物质的前体，对于酒体风格的体现有重要的作用[36]。酯类物质中，以乳酸乙酯、丁酸乙酯为主体香气物质，质量浓度分别达到了（259.894±10.748）μg/100 mL和（187.552±0.845）μg/100 mL，与传统酒曲酿造米酒比较，质量浓度远远高于其（19.922±0.267）μg/100 mL和（0.867±0.013）μg/100 mL，赋予酒体多种果香味，是酒中香气组成的重要物质，影响酒体的香型及风格[37]。酸类物质能与醇类物质反应生成相应的酯类物质，从而赋予酒体香味，适量的酸类物质能提高酒体的整体协调性，过高或过低都会给酒体呈香带来负面影响[38]。其乙酸含量相对都较大，实验曲酿酒乙酸质量浓度达到（560.939±18.185）μg/100 mL，而传统曲酿酒为（135.240±5.113）μg/100 mL，这与易欣等[39]研究一致。醛类物质对酒体香味也有一定影响，乙醛能赋予酒体果香、咖啡香、且带有一定清香，实验曲酿造米酒中3 种醛类物质含量均高于传统曲酿酒。

3 结 论

以药食同源物质制曲，通过单因素试验和Box-Behnken设计试验，采用响应面分析法优化药食同源物质制曲工艺条件，确定的优化工艺条件参数为：根霉接种量0.3%、培曲时间40 h、基质含水量65%和培曲温度28 ℃，在此条件下实验曲糖化酶活力为（779.233±0.577） mg/（g·h）。在本实验范围内建立的二次线性回归模型准确有效，可用来预测设定条件范围内及其周围的药食同源物质制曲工艺参数，对实验有较好拟合性，有一定的实用价值。对实验曲酶系测定结果表明，糖化酶、液化酶、酸性与中性蛋白酶、纤维素酶活力等均极显著高于传统曲（P＜0.000 1），说明实验曲具有良好的发酵性能。对实验曲酿酒主要33 种物质分析表明，醇类以正丙醇（75.488±17.389）μg/100 mL、异戊醇（109.394±14.474）μg/100 mL、正乙醇（100.364±24.177）μg/100 mL为主，酯类物质中以乙酸乙酯（76.468±1.513）μg/100 mL、乳酸乙酯（19.922±0.267）μg/100 mL居多，赋予酒体果香和酯香，酸类以乙酸（135.240±5.113）μg/100 mL、丙酸（34.879±17.671）μg/100 mL居多，说明采用药食同源基质制曲，在微生物作用下，基质中的有效成分能够很好地融入酒体，提高米酒的营养成分。发酵所得的黑糯米酒暗红发亮，酒体清澈，质地均匀，有淡淡药香，酸甜可口，口感醇厚柔和，是一种能受到消费者喜爱的米酒。