空间位阻净化-超高效液相色谱-串联质谱技术测定动物源性食品中抗组胺类药物残留

王 京，叶佳明，王 潇，钟世欢，陈青俊

（1.赞宇科技集团股份有限公司，浙江 杭州 310030；2.浙江省轻工业研究所，浙江 杭州 310009；3.浙江公正检验中心有限公司，浙江 杭州 311305）

随着膳食结构的不断改善和对动物性蛋白质需求的不断增加，人们对肉制品、奶制品和鱼制品等动物性食品的质量要求也就越来越高，对食品的兽药残留引起了普遍关注，并认为兽药残留将是今后食品安全性中重要问题之一[1-2]。抗组胺类药物，可用于镇吐、抗晕眩、晕动症以及镇静催眠。其在兽医临床上的药理作用广泛，饲料中添加此类药物，能兴奋摄食中枢，不法商人在动物养殖过程中对其非法使用，从而达到增加动物采食和促进生长增加体重等作用[3]；另外，使用抗组胺类药物可降低动物运输过程中的死亡率。因该类药物脂溶性高，易蓄积于脂肪组织，停药数周乃至半年后，尿中仍可检出其代谢物，且部分代谢物仍具有药物活性；例如氯丙嗪、异丙嗪等药物经肝脏代谢，在细胞色素P450酶催化下被氧化为亚砜结构物质，会引起白细胞减少和粒细胞缺乏症，从而引起人体肝脏、肾脏的病变，还会引起眼部并发症等[4]。抗组胺类药物在养殖业中的使用已经引起了美国、欧盟和日本等国家的高度重视。

目前有关动物源性食品中多种抗组胺类药物的测定方法还较少，鲜见对同时测定动物源性食品中19 种抗组胺类药物及其代谢物的研究。相关文献主要仅检测氯丙嗪、异丙嗪及其代谢物[5-7]，大部分研究局限于法医学方面[8-10]。国内外检测低浓度水平的兽药残留通常采用的方法为液相色谱-串联质谱法[11-15]和气相色谱-质谱法[16-17]，其中液相色谱-串联质谱法数据通量大，无需衍生化且定性能力强，是一种灵敏度和选择性极高的检测手段。由于动物源性食品种类多、基质复杂，标准方法和文献报道多数采用固相萃取柱[18-19]、多功能净化柱[20]等净化手段，其步骤复杂、实验成本高。本研究旨在建立一种基于超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），结合空间位阻净化技术[21-22]，实现同时测定19 种抗组胺类药物及其代谢物残留。本方法简便快速，灵敏度满足实际样品的检测需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙酸乙酯、乙腈、甲酸（均为色谱纯） 德国Merck公司；柠檬酸钠、柠檬酸氢钠、氯化钠、硫酸镁、Na2EDTA（均为优级纯） 上海谱振生物科技有限公司；EMR-Lipid吸附剂 美国Agilent公司；实验用水为Millipore-iQ高纯水净化仪制得。

19 种抗组胺药物标准品（特非那定、阿司咪唑、西替利嗪、氯雷他定、羟嗪、溴苯那敏、地氯雷他定、赛庚定、氯苯那敏、曲吡那敏、苯海拉明、氯丙嗪、氯丙嗪亚砜、异丙嗪、异丙嗪亚砜、氟奋乃静、氟奋乃静亚砜、奋乃静、奋乃静亚砜） 德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

1260II超高效液相色谱仪-串联6470三重四极杆质谱仪 美国Agilent公司；MultiReax旋涡振荡器 德国Heidolph公司；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；N-EVAP112水浴式氮吹仪美国Organomation公司；Millipore-iQ高纯水净化仪美国Millipore公司；AS 3120超声波振荡器 天津特赛恩斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 预处理

1.3.1.1 空间位阻净化法

称取经均质的试样5.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 mL超纯水、20 mL的乙酸乙酯-乙腈（20∶80，V/V）提取液，匀浆后超声提取10 min，离心（8 000 r/min，5 min）后取清液加入2 g预先用3 mL水活化的EMR-Lipid吸附剂，涡旋振荡并离心（8 000 r/min，5 min）；取全部清液加入5 g盐（NaCl-MgSO4，1∶4，m/m），立即剧烈振摇并离心（4 ℃，8 000 r/min，5 min）；取上清液在40 ℃水浴中氮吹至尽干，加入1 mL初始比例的流动相（含0.1 mol/L Na2EDTA）复溶后过0.22 μm滤膜供UPLCMS/MS测定。

1.3.1.2 CEN法

称取经均质的试样5.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，分别加入10 mL超纯水、10 mL甲酸-乙腈（10∶90，V/V）提取液，超声30 min，加入1 g柠檬酸钠、1 g氯化钠、4 g硫酸镁、0.5 g柠檬酸氢钠，涡旋振荡并离心（5 000 r/min，5 min）。取5 mL上清液加入0.75 g硫酸镁、0.25 g N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）、0.15 g C18和0.15 g Al-N，涡旋振荡并离心（5 000 r/min，5 min），取上清液1 mL用0.1%甲酸溶液定容至10 mL，混匀后过0.22 μm滤膜供UPLC-MS/MS测定。

1.3.1.3 AOAC法

称取经均质的试样5.0 g于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL超纯水、25 mL乙腈，匀浆提取后，分别加入10 g硫酸镁、1 g氯化钠，匀浆并离心（5 000 r/min，5 min）。取上层乙腈4 mL加入1.2 g硫酸镁、0.1 g PSA、0.1 g C18，涡旋振荡并离心（5 000 r/min，5 min），取上清液过0.22 μm滤膜供UPLC-MS/MS测定。

1.3.2 标准溶液的配制

标准储备液（1 mg/mL）的配制：准确称取19 种药物标准物质各10.0 mg，用乙腈分别溶解定容至10.0 mL，于－18 ℃冷冻保存。

标准混合储备液（10 μg/mL）的配制：分别取标准储备液1.0 mL混合，用乙腈定容至100 mL，于－18 ℃冷冻保存。

标准混合空白工作液的配制：取标准混合储备液，用初始比例流动相稀释成1、2、5、10、20、50、100 μg/L系列质量浓度的标准混合空白工作液。

基质匹配混合标准溶液配制：取阴性样品，按照1.3.1节的预处理方法处理浓缩至近干，加入标准混合空白工作液1.0 mL后按1.3.1节继续操作，即得。

1.3.3 UPLC-MS/MS测定

表1 19 种药物的质谱采集参数Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters of 19 drugs

LC条件：Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 µm）；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；进样量10 μL；流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～3 min，10%～10% B；3～6 min，10%～30% B；6～8 min，30%～40% B；8～12 min，40%～70% B；12～14 min，7%～90% B；14～16 min，90%～90% B；16～16.5 min，90%～10% B。

MS条件：Agilent Jet Stream电喷雾离子源；动态多反应监测模式采集数据；干燥气温度350 ℃；干燥气流量10 L/min；鞘气流量12 L/min；雾化气压力25 psi；毛细管电压4 000 V；MS/MS分辨率为unit；19 种抗组胺药物的质谱参数见表1。

定量方法：取1.3.2节制备的样液上机测定绘制标准曲线，再取1.3.1节制备的样液上机测定，以保留时间和2 对特征离子对定性，以定量离子的峰面积计算样液中目标物的含量。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

在电喷雾离子源正离子全扫描模式下分别对19 种质量浓度为1 μg/mL的抗组胺药物进行分析，所有待测物均形成[M＋H]＋形式的准分子离子峰。在单离子扫描模式下分别优化每个待测物的裂解电压使母离子响应最大，后在子离子扫描和多反应监测分析中确定两对定性离子对和一对定量离子对，并优化其碰撞能使子离子响应最大化。同时，在多残留检测中为尽可能地提升灵敏度和定量的准确性，采用动态多反应监测模式进行数据采集，以根据不同待测物的保留时间，分段进行多反应监测扫描，增加每个待测物的扫描驻留时间，从而加大目标离子的通量提高数据采集效率，进而提升灵敏度、保证重复性。

2.2 色谱条件的优化

因西替利嗪和羟嗪；氟奋乃静、氟奋乃静亚砜、奋乃静和奋乃静亚砜；氯丙嗪、氯丙嗪亚砜、异丙嗪和异丙嗪亚砜具有结构相同的母核，质谱行为接近，在二级质谱中产生相同的丰度较高的子离子碎片，为准确定量需保证色谱上的分离度。本研究综合考虑系统耐压、分析时间和分离效果，主要对比了Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 µm）、Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）、Cortecs C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 µm）、XBridge C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）和Accucore Vanquish C18柱（100 mm×2.1 mm，1.5 µm）5 种色谱柱。综合各方面因素最终选取柱效较高且背压较低的Poroshell 120 C18柱，能达到理想的实验效果。

根据经验和文献资料，酸性流动相体系在正离子模式下能增强待测物的离子化效率从而提高灵敏度，乙腈和甲醇相比具有更小的基线噪音影响和更强的反相洗脱能力，从而增大梯度洗脱程序设计的灵活性，故选择乙腈为有机相。本研究主要对水相添加不同浓度的甲酸和甲酸铵与乙腈进行组合，考察其响应值，结果以某种水相与A种水相中19 种药物响应平均值的比值计算，制作变化图（图1）。结果表明：水相中加入甲酸和甲酸铵都能明显提升灵敏度，0.1%的甲酸添加量能达到最佳灵敏度。为保证梯度洗脱的稳定性，同时在乙腈中加入相同的0.1%甲酸。最终确定0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相，所有19 种待测物的典型多反应监测图见图2。

图1 不同流动相的比较Fig. 1 Comparison of different mobile phases

图2 19 种药物的典型多反应监测谱图Fig. 2 Typical MRM chromatograms of 19 drugs

2.3 预处理方法的优化

动物源性食品通常含大量的脂肪、蛋白质等物质，在预处理过程中动物细胞膜的主要成分磷脂也会源源不断溶出，这些物质在离子源会与待分析物竞争电子引起很大的基质效应，严重影响定量的准确性，因此如何最大程度地净化来削弱基质效应是分析的主要难点。兽药残留检测的常用提取溶剂有缓冲盐溶液、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，加入适量的甲酸或氨水也能促进提取；19 种抗组胺类药物极性均较弱但是极性范围较宽，实验表明使用缓冲盐溶液或甲醇作为提取剂时特非那定等药物的回收率不足40%，使用乙酸乙酯作为提取剂时曲吡那敏等药物的回收率不足60%，而使用乙腈和乙酸乙酯的混合溶液作为提取剂能覆盖大部分的待测物的极性；19 种抗组胺类药物的pKa值范围在3.7～9.3之间，故不加入甲酸或氨水促进提取，最终选择乙酸乙酯-乙腈（20∶80，V/V）作为提取溶剂。

分散固相萃取技术是目前实验室开展药物残留检测工作主流的预处理手段[23-31]，它兼顾了净化效果和效率，AOAC法和CEN法等国际方法中主要用的吸附剂有PSA、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、十八烷基键合硅胶（C18）、中性氧化铝（Al-N）等，其中PSA和Al-N主要吸附极性杂质、GCB主要吸附色素同时会对平面结构的化合物存在共吸附、C18主要吸附脂类和糖类物质但是因针对性较差也引起一些亲脂类化合物回收率偏低；EMR-Lipid技术是一种基于空间位阻原理的特殊聚合物基质EMR的净化手段，专门吸附脂质中C5及以上的碳链，对脂质具有非常强的选择吸附性。由于19 种抗组胺类药物的极性均较弱，因此在反相色谱上的共馏出物于离子源处形成基质效应的物质主要是磷脂等弱极性的物质，本研究考察了通过空间位阻净化法、CEN法和AOAC法净化猪肉样品后的磷脂残留来评价3 种预处理方式的净化效果，磷脂并非单一化合物，主要分为甘油磷脂和鞘磷脂两大类，但是其含磷酸的母体是相同的，故可采用母离子扫描模式监测184＋碎片离子来监测磷脂残留量。如图3所示，可知空间位阻净化法的磷脂残留最少，CEN法净化后仍有一定量的磷脂存在，AOAC法净化后磷脂残留最多，因此最终确定了空间位阻净化法为本研究的预处理手段。

图3 猪肉样品经3 种方法净化后的磷脂残留监测对比图Fig. 3 Comparison of phospholipid residues in pork samples purified by three methods

由于氯丙嗪、异丙嗪、奋乃静、氟奋乃静等吩噻嗪类抗组胺药物具有相同的硫氮杂蒽母核，其环上硫原子所具有的两对孤对电子极易与基质中的金属离子络合甚至被仪器金属管路吸附，造成峰形拖尾、重复性差等现象，Na2EDTA能竞争络合基质中的金属离子使待测物母核游离出来，因此最终复溶时用流动相加入Na2EDTA（最终浓度为0.1 mol/L）较好地改善了重复性。

2.4 基质效应的考察结果

液相色谱-质谱分析中存在的基质效应，除了在预处理过程中尽可能净化样品，通常采用稀释法、标准加入法、内标法、基质配标法来削弱或修正基质效应造成的偏差；本研究以基质效应最明显的猪肝为例，通过优化梯度洗脱程序和基质配标法较好地减弱和抵消了基质效应，比较结果见表2。

表2 19 种药物的基质效应Table 2 Matrix effects of 19 drugs

2.5 方法学考察结果

2.5.1 线性与检出限结果

表3 19 种药物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 19 drugs

按上述条件将系列混合标准工作溶液上机测定，以峰面积为纵坐标（y），以质量浓度（ng/mL）为横坐标（x）制作标准工作曲线，得到线性方程的线性回归系数r2均大于0.999，表明19 种抗组胺药物在相应的质量浓度范围内线性良好。采用标准添加法进行测定，以定性子离子的3 倍信噪比计算检出限和10 倍信噪比计算定量限，结果见表3，得到19 种抗组胺药物检出限为0.2～2.0 μg/kg，定量限为0.6～6.0 μg/kg，灵敏度满足实际样品检测的需要。

2.5.2 回收率与重复性结果

在阴性牛肉、鸡肉和猪肝中分别添加3个质量浓度水平的混合标准溶液进行6 次回收率实验，结果见表4。可知回收率在75.1%～89.1%之间，相对标准偏差为2.3%～7.1%，方法具有较好的精密度，能满足实际样品的检测需要。

表4 19 种兽药的准确度和精密度（n=6）Table 4 Accuracy and precision for 19 drugs (n= 6)

2.5.3 实际样品检测结果

采用本方法对流通领域市售鸡肉86 份、牛肉91 份、猪肝77 份进行19 种抗组胺药物及其代谢物的筛查，检出猪肝氯丙嗪阳性样品3 例、异丙嗪阳性样品1 例，检出牛肉氯丙嗪阳性样品1 例、奋乃静阳性样品1 例；全部阳性样品同时均检出其亚砜结构代谢物，可见通常代谢物与本体会同时存在，内脏等脂肪含量高的组织更易蓄积抗组胺类药物及其代谢物。

3 结 论

本实验建立UPLC-MS/MS同时测定畜禽肉中19 种抗组胺药物及其代谢物残留的方法。通过比较空间位阻净化法、CEN法和AOAC法3 种不同前处理方法的净化效果，验证了空间位阻净化法的有效性。通过优化色谱和质谱参数，得到了最佳的仪器检测条件。方法学考察和实际样品的测定证明该方法实用、可靠。与目前的国家标准和文献报道的方法相比，本方法在扩大了同类型药物检测范围、准确性较好、灵敏度较高的同时，尽可能省去了复杂的前处理，节省了成本，能更快更好地为市场监管部门的监督执法提供技术支持。