伤寒沙门菌三基因敲除株的构建及其减毒效果分析

穆媛媛,熊 坤,刘 璐,樊 佳,张 丹,余 玥,邓 冲,魏 聪,赵 容△

(1.辽河油田中心医院消化科,辽宁盘锦 124010;2.陆军军医大学微生物学教研室,重庆 400038; 3.西南医科大学附属中医医院检验科,四川泸州 646000)

根据世界卫生组织最新数据，全球伤寒感染者约为1 700万[1]，是一个严重的公共卫生问题。针对伤寒的感染途径，减毒疫苗具有免疫机制全面、成本低廉、使用方便、顺应性高等优势，是控制伤寒的有效手段。本研究将伤寒沙门菌3个参与铁载体转运的基因iroN、fepA、cirA全部敲除，构建三基因敲除株，并采用动物模型对突变株的毒力进行检测。

1 材料与方法

1.1菌株和培养基 研究使用的菌株、质粒和引物见表1。细菌采用LB培养基培养，如有需要，抗生素按以下浓度加入培养基：卡那霉素50 μg/mL；氨苄西林100 μg/mL。TMM基本培养基：磷酸氢二钾7 g/L；磷酸二氢钾1 g/L；硫酸镁0.2 g/L；柠檬酸钠0.5 g/L；半胱氨酸0.1 g/L；色氨酸0.1 g/L；硫酸铵0.1 g/L；葡萄糖5 g/L；pH 7.6。贫铁培养基：以TMM培养基为基础，加入180 μmol/L铁螯合剂2,2/-dipyridyl制成，使用前加入氯化铁至终浓度为5 μmol/L。

表1 菌株、质粒和引物

1.2伤寒沙门菌三基因敲除株的构建 参考文献[2-3]，采用同源重组法将cirA、fepA、iroN3个基因从细菌染色体上一一敲除。以cirA基因的敲除为例说明如下：以伤寒沙门菌基因组DNA为模板，采用crossover PCR扩增伤寒沙门菌上下游序列并拼接在一起。即以P11和P12为引物扩增cirA基因上游序列，以P13和P14为引物扩增cirA基因下游序列，两次PCR产物混合作为模板，以P11和P14扩增，由于P12和P13引物序列中有一段33bp的互补序列(表1)，通过PCR扩增可使上下游序列拼接在一起。PCR产物经BglⅡ和ApaLⅠ双酶切后插入自杀质粒pYG4中，并测序验证。获得的pYG4-ΔcirA质粒电转化到伤寒沙门菌中，采用含有卡那霉素的LB平板筛选质粒整合株(pYG4质粒含有卡那霉素耐药基因)。获得的整合株于液体LB培养基中培养过夜，取菌液涂布在含有5%蔗糖的LB固体培养基上继续培养。pYG4质粒上有sacB基因，该基因编码产物果聚糖合酶，可以分解蔗糖并合成高分子量的果聚糖，进而造成细菌死亡。因此带有该质粒的细菌无法在含有5%蔗糖的LB平板上生长，只有该质粒通过同源重组从染色体上丢失后，细菌才能生长。同源重组的结果有两个，细菌恢复为野生型，或者成为敲除株，可以通过PCR进行鉴定。故在培养16 h后，挑取菌落鉴定其卡那霉素敏感性，对卡那霉素敏感的菌落(染色体上的质粒序列丢失)进行PCR和测序鉴定，鉴定准确的敲除株ΔcirA保存于-80 ℃。接下来采用同样的方法，以ΔcirA作为亲本，将fepA基因敲除，进而将iroN基因敲除，最终获得的三基因敲除株保存-80 ℃备用。

1.3三基因敲除株生长特征分析 将10 μL细菌新鲜培养物(约含1×104CFU/mL)接种于10 mL 贫铁培养基中(3个平行管)，于37 ℃震荡培养，每隔2 h取1 mL培养物测定600 nm吸光度，绘制生长曲线。

1.4三基因敲除株半数致死量(LD50)测定 采用小鼠胃黏蛋白增毒模型测定三基因敲除株和野生株的LD50。6～8周龄的BALB/c小鼠随机分5组，每组6只。取细菌新鲜培养物经PBS洗涤后测定OD值，重悬于10%的猪胃黏蛋白液中配制系列浓度(野生5×105CFU/mL；三基因敲除株5×103～5×107CFU/mL)的菌悬液。取0.5 mL菌悬液进行腹腔注射，动物禁食喂水，观察记录72 h内小鼠的死亡情况，采用概率单位加权回归法(Bliss法)计算LD50。

表2 LD50测定结果

NA:未做

2 结 果

2.1构建并获得三基因敲除株 成功将伤寒沙门菌Ty2株的3个参与铁载体转运的基因iroN、fepA、cirA一一敲除，如图1所示，当以一对被敲除基因外围的引物分别扩增野生株和敲除株的基因组DNA时，敲除株由于目的基因被敲除，故扩增片段较野生株明显小。PCR鉴定的结果显示，3个基因均被有效敲除。

1：分子量标准；2:引物P11和P14 PCR扩增产物(三基因敲除株)；3:引物P11和P14 PCR扩增产物(野生株)；4:引物P21和P24 PCR扩增产物(三基因敲除株)；5:引物P21和P24 PCR扩增产物(野生株)；6:引物P31和P34 PCR扩增产物(三基因敲除株)；7:引物P31和P34 PCR扩增产物(野生株)

图1敲除株PCR鉴定电泳图

图2 细菌在贫铁培养基中培养的生长曲线

2.2三基因敲除株在贫铁培养基中生长较野生株缓慢 采用2,2′-dipyridyl将培养基中的铁离子螯合，然后在培养基中加入微量三价铁造成一个贫铁的环境。生长曲线测定显示，三基因敲除株在这种贫铁环境中的生长较野生株明显缓慢(图2)。

2.3三基因敲除株毒力显著下降 为了进一步测定和评价三基因敲除株及野生株的毒力，本研究采用小鼠急性感染模型测定了伤寒沙门菌野生株和敲除株的LD50，分别为3.64×101CFU和3.56×106CFU(表2)。

3 讨 论

伤寒的自然感染途径是粪-口途径，其保护性免疫机制包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫[4]，其中黏膜免疫可以有效阻止病原体在肠黏膜表面的定居和繁殖，对于阻断再次感染发挥了重要作用。因此，针对伤寒的疫苗设计，口服减毒疫苗方式具有很多优势：(1)减毒疫苗通过自然感染途径接种，除了诱导体液免疫、细胞免疫外，还可以有效诱导黏膜免疫，免疫机制全面，免疫效果好；(2)其次在接种方式上，口服方式比较方便、简单，不需要注射器和专业的医务人员。为非侵入性接种，接种者顺应性高，尤其适合儿童。(3)避免疫苗与全身循环的直接接触，减轻不良反应。(4)沙门菌减毒疫苗生产工艺简单，疫苗成本相对较低。沙门菌减毒疫苗的研制和应用已有很长的历史，例如伤寒沙门菌Ty21a和众多鼠伤寒沙门菌减毒株等，其良好的安全性得到大量实验和临床应用的证实[5-6]。另外，沙门菌是最早应用于疫苗载体的细菌之一，也是目前研究最深入的活菌疫苗载体，已被广泛用于病毒、细菌、寄生虫、肿瘤等疫苗的研制并展示了良好的应用前景[5-6]。

本研究通过敲除涉及铁载体转运的3个基因实现细菌的减毒，理论依据是铁摄取功能对于细菌生存至关重要。虽然自然界中有非常丰富的铁元素，然而对于细菌来说，却是个“贫铁”的环境。这是因为铁在有氧条件下主要以三价铁形式存在，在中性及偏碱性环境中，三价铁由于形成Fe(OH)3以及羟基氧化铁而几乎不溶，细菌很难直接从环境中获得游离铁的供应[7-9]。为了生存，多数细菌会通过合成并分泌铁载体(siderophores，一种与铁离子具有高亲和力的螯合剂)到环境中去争夺铁离子[7]；然而，结合了铁的铁载体并不能直接通过细菌外膜回到菌体内，必须借助外膜上TonB依赖的转运蛋白(TonB-dependent Transporters,TBDTs)的转运[7]。与之相似，在人和动物体内，铁元素主要以结合方式存在于转铁蛋白、乳铁蛋白等铁蛋白中而无法被自由利用，但细菌同样可以通过铁载体从这些含铁蛋白中争夺铁元素，再由转运蛋白转运到菌体内利用。既往研究显示，这些涉及铁摄取的TBDTs 对病原菌在体内的生存和致病有重要作用[7-9]。

实验研究和生物信息学分析显示伤寒沙门菌一共有6个TBDTs(FoxA、YncD、BtuB、IroN、FepA和CirA)，其中5个涉及铁转运。FoxA转运高铁氧胺铁载体；YncD涉及转铁，但铁载体类型未知。IroN、FepA和CirA主要涉及儿茶酚胺类铁载体，IroN能转运2,3-二羟苯甲酰基丝氨酸、肠菌素、沙门螯合素；FepA能够转运2,3-二羟苯甲酰基丝氨酸和肠菌素；而CirA只能转运2,3-二羟苯甲酰基丝氨酸，三者在功能上具有一定互补性[10-12]。本研究结果表明，当3个基因被敲除后导致细菌毒力显著下降，表明以这3个基因作为减毒的敲除靶基因是适合的。当然，后续还需要对减毒株的免疫保护效能及其免疫机制进行全面而系统的研究，才有可能将该减毒株纳入伤寒疫苗株的候选。