大鼠脊髓突触体的制备及神经递质的定性和定量分析

刘正，王静，沈伟，赵舒煊，袁文华，冯晓飞，周海宇

1.兰州大学第二医院骨科，甘肃兰州市730030；2.甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃兰州市730030；3.解放军第九四三医院特诊科，甘肃武威市733000

突触是神经元相互接触的部位，是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。突触体最早由Whittaker等[1]命名，是指具有突触区完整形态结构的封闭颗粒，某种意义上可被认为是功能完整的活细胞[2]，但与细胞又有很大区别。

在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中，突触传递最重要的方式是神经化学传递。神经递质是指神经末梢释放的特殊化学物质，它能作用于支配的神经元或效应细胞膜上的受体，从而完成信息传递功能[3]。

神经递质分为四类，即生物原胺类、氨基酸类、肽类和其他类。生物原胺类神经递质是最先发现的一类，包括多巴胺(dopamine,DA)、肾上腺素(epinephrine,E)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、5-羟色胺(serotonin,5-HT)及其相关代谢产物高香草酸(high vanillic acid,HVA)、3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)、5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)、左旋多巴(levodopa,L-DOPA)[4]等。氨基酸类神经递质包括γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid,GABA)、甘氨酸(glycine,Gly)、 谷氨酸(glutamate,Glu)、组胺(histamine,His)、乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)等。这些神经递质在中枢神经系统中起着重要的作用，参与机体多种生理过程，其含量与人体健康密切相关[5]。例如，阿尔茨海默病[6]、抑郁症[7]、帕金森病[8]、尿毒症[9]、嗜铬细胞瘤[10]、白内障[11]等都与其中的神经递质有密切联系。

目前，有多种方法用于测定神经递质，如荧光检测液相色谱法[12]、电化学分析法、荧光法[12]、气相色谱-质谱法[13]和生物法[14]等，多用于测定和研究大脑部分区域的神经递质。本研究旨在制备大鼠脊髓突触体，并建立一种测定方法，去检测大鼠脊髓突触体中含有哪些神经递质，对神经递质进行定性和定量分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性Sprague-Dawley大鼠32只，标准体质量，由兰州大学医学院实验动物中心提供；实验动物生产许可证号SCXY(甘)2009-0004；使用许可证号SYXK(甘)2009-0005。本实验经兰州大学第二医院伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与设备

Thermo Ultimate 3000超高效液相色谱系统、Thermo Q Exactive四级杆静电场轨道阱高分辨质谱、Allegra 64R超高速离心机：美国赛默飞世尔科技公司。SIGMA3-30k离心机：北京五洲东方科技发展有限公司。300 kV高分辨率电镜Tecnai、F30透射电镜：荷兰Philips-FEI公司。CentriVap型Labconco离心浓缩系统、超纯水仪：英国ELGA公司。BP1215分析天平：德国SATORIUS公司。

1.3 主要试剂与配制

DA、HVA标准品：日本东京化成工业。NE、5-HT、DOPAC、5-HIAA、GABA、3-甲氧酪胺(3-methoxytyramine,3-MT)、 色 氨 酸 (tryptophan,TRP)、 犬尿氨酸(kynurenine,KYN)、3-羟基犬尿氨酸(3-hydroxy kynurenine,3-HK)、3-羟基-2-氨基苯甲酸(3-hydroxy-2-aminobenzoic acid,3-HAA)标准品：美国密苏里州SIGMA-ALDRICH公司。E标准品：加拿大多伦多研究化学公司。

内标GABA、甲酸、甲醇、乙腈、丙酮(色谱纯)：德国达姆施塔特默克公司。其他同位素内标：加拿大TORONTO RESEARCH CHEMCALS公司。丹磺酰氯：日本东京化成工业。Percoll分层液：美国GE HEALTHCARE公司。实验用水为超纯水(电阻率≥18.2 MΩ·cm)。

标准溶液和质控溶液的配制：准确称取适量标准品和同位素内标，用甲醇溶液溶解并配置成1 mg/ml的各单标储备溶液；进而用甲醇梯度稀释配置为10 μg/ml的混合标准应用液，混合内标应用液200 ng/ml；所有溶液储存于-20℃冰箱备用；工作标准系列用标准应用液梯度稀释而成。10点校正曲线覆盖线性范围0.02～20 ng(0.02 ng，0.05 ng，0.1 ng，0.2 ng，0.5 ng，1 ng，2 ng，5 ng，10 ng，20 ng)；质控溶液用同样的方法配置，质控浓度为 1 ng(低)，2 ng(中)，5 ng(高)。

1.4 大鼠脊髓突触体的制备

断头处死大鼠后在冰面上取出完整脊髓，将脊髓放入装有4℃蔗糖缓冲液的烧杯中洗涤，去除杂质。从缓冲液中取出脊髓，用滤纸吸干后称重，剪碎，然后将其放入预冷的研磨管，按1∶8(W/V)加入4℃蔗糖缓冲液，手动匀浆8次。然后将匀浆液装入10 ml离心管中，用SIGMA 3k15离心机4℃、3600 r/min离心15 min。取上清液2 ml均匀缓慢平铺于3%Percoll梯度层上，用SIGMA 3-30k离心机4℃、20 000 r/min离心6 min。抽取第三、四层，按1∶5(W/V)加入到4℃蔗糖缓冲液中稀释，在烧杯中混匀，装入10 ml离心管，4℃、15 000 r/min离心20 min。取出沉淀，4℃蔗糖缓冲液适当稀释后，装入1.5 ml EP离心管，4℃、12 000 r/min离心5 min，弃上清液，即得纯化脊髓突触体(图1)。大鼠脊髓突触体制备见图2。

图1 Percoll密度梯度离心分层

图2 大鼠脊髓脊髓突触体制备简图

1.5 透射电镜观察

将1.4节中离心后所得沉淀加入适量(约沉淀的10倍体积)2.5%戊二醛行前固定，4℃过夜，0.1 mol/L磷酸盐漂洗3次后用1%锇酸行后固定，再次漂洗后树脂渗透包埋，常温下固化1周，修块，透射电镜常规超薄切片，2%醋酸双氧铀染色20 min、柠檬酸铅染色10 min，即可观察。

1.6 神经递质的测定

组织样本置于1.5 ml EP离心管中；加入萃取液450 μl，水∶甲醇=1∶3(V/V)，加入混合内标应用液50 μl；以Tissuelyser仪器进行均质化。均质化条件：不锈钢珠(直径3 mm)1粒，振动频率30 Hz，震动时间3 min，重复3次；15 000 r/min高速冷冻离心15 min；吸取上清，转移至干净1.5 ml EP离心管中，真空浓缩至干，进行衍生化反应。

衍生化反应：碳酸氢钠(pH=11.0，0.2 mol/L)溶液50 μl和丹磺酰氯(2 mg/mL)溶液 50 μl加入挥干的样品中，涡旋1 min；60℃水浴锅中反应8 min。反应溶液18 000 r/min高速冷冻离心10 min，取上清80 μl转移至带玻璃内衬管的进样小瓶中，进样5 μl上机测定。

1.7 色谱条件

ThermoUltimate 3000超高效液相色谱系统；Acquity UPLC®BEH-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱温35℃；流动相A为乙腈+0.1%甲酸；流动相B为纯水+0.1%甲酸；流速为0.25 ml/min；进样量5 μl。梯度条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

1.8 质谱条件

Thermo Q Exactive四级杆静电场轨道阱高分辨质谱仪。离子源：HESI-II，正离子模式。源区条件：喷雾电压3 kV，毛细管温度350℃，加热温度425℃，S-lens RF水平50；鞘气50，辅助气13，反吹气3。所有源区参数单位为仪器自设单位(arbitrary unit)。氮气被用作HCD碰撞池的碰撞气和C-trap的阻尼气；扫描类型为Targeted-MS/MS；分辨率为17 500。仪器控制、数据采集和分析均使用Xcalibur 2.2软件(美国赛默飞世尔科技)。质谱参数见表2。

1.9 统计学分析

采用SPSS 23.0软件对所得数据进行统计学分析。计量资料进行正态性检验，符合正态分布的数据以()表示，采用t检验。本实验均采用雌性大鼠，故不考虑性别对实验结果的影响。显著性水平α1=0.05，非常显著性水平α2=0.01。

2 结果

2.1 大鼠脊髓突触体电镜图

大鼠脊髓突触体是具有完整形态的椭圆形结构，突触小泡、线粒体等包含在其中。见图3。

2.2 神经递质的测定

混合标准溶液的色谱图见图4，样品色谱图见图5。

表2 UHPLC-MS/MS质谱参数

图3 大鼠脊髓突触体电镜图

图4 标准品色谱图

图5 样品色谱图

准确量取适量标准品，将其定量混合并用标准品溶液稀释，得到一系列质量浓度不同的溶液，按照1.7，1.8节色谱、质谱条件进样分析，对上述系列浓度各测定6次后，取其峰面积的平均值，以进样质量浓度X对峰面积Y作图，绘制标准曲线。各神经递质线性方程、相关系数见表3。

表3 各神经递质的线性方程、相关系数

3 讨论

生物样品中神经递质含量很低，通常在血液中仅为pmol/ml级[15]，且生物样品本身基体复杂，内源性干扰因素很多，因此神经递质的测定异常困难。本实验目的是测定大鼠脊髓突触体中所含有的神经递质，并对其进行定性、定量分析。哺乳动物的不同组织，都存在神经递质的合成和分泌过程[16]。国内外大多数关于神经递质测定的研究都集中在大脑，鲜有在脊髓。因此我们从脊髓方向对神经递质进行测定研究。

我们需要大鼠脊髓中的突触体，不是所有脊髓成分，因此我们用不连续性Percoll密度梯度离心法[17]将大鼠脊髓突触体提出，用超高效液相色谱-质谱联用法[18]对脊髓突触体进行检测分析。本实验检测出大鼠脊髓突触体中含有DA、NE、5-HT等单胺类神经递质，GABA、TRP等氨基酸类神经递质，以及DA代谢产物DOPAC、HVA、3-MT，5-HT代谢产物5-HIAA，TRP代谢产物KYN、3-HK、3-HAA。本实验与其他国内外研究者在测定大脑中所含神经递质的结果有很大不同。

表4 大鼠脊髓突触体中神经递质的含量(ng/g)

多数研究者采用高效液相色谱法[19]测定出大鼠大脑中含有8种单胺类神经递质以及Glu、GABA、Gly、Asp等几种主要氨基酸。本实验测定出3-MT、KYN、3-HK、3-HAA，经查询相关文献并未在大脑中测出。其中3-MT是DA的代谢产物，KYN、3-HK、3-HAA是TRP的代谢产物。3-MT在多巴胺能神经元的细胞体中合成[20]，并储于纹状体的含致密中心囊泡的膨体中，在DA神经元兴奋时可导致其末梢释放，通过激活独特的DA受体，而产生生理效应。3-MT在医疗上用作升压药，作用为兴奋心脏、增强肾血流量。KYN、3-HK、3-HAA是TRP在犬尿氨酸途径[21]生成的代谢中间产物，犬尿氨酸途径与心血管疾病有密切联系。用同一种方法，其他研究者在测定大脑中神经递质时，只测出其中含有几种单胺类神经递质，或者用同一种方法，只测出其中含有几种氨基酸。没有相关文献报道他们在大脑中同时测出含有单胺类和氨基酸类神经递质。我们在大鼠脊髓突触体中检测出这两类神经递质。

以上结果说明大脑和脊髓突触体中的神经递质虽有许多相同之处，但还是有一些细微的差别；也间接说明脊髓突触体是具有生理活性的物质。它类似于一个功能完整的活细胞[2]，但与细胞又有很大区别，无论是从形态还是内在结构。我们测出脊髓突触体中所含有的神经递质，对于临床有很大帮助。例如，阿尔茨海默病[22]患者5-HT系统严重受损，5-HT是维持大脑正常智力的重要递质；高血压[23]患者NE水平发生改变，导致血管收缩，血压升高；白内障患者3-HK水平改变，可以放大氧化应激反应，修饰晶状体蛋白[24]。对这些神经递质进行分析研究，能得出某种神经递质与某种疾病之间存在的关系，这有助于我们对临床疾病做出正确的诊断以及治疗方案。下一步我们将从脊髓突触体出发，研究脊髓损伤后如何使患者尽可能向正常生理状态恢复，这是临床上较难克服的问题。