益血方对急性脑梗死大鼠血管新生的作用及对促血管生成因子HIF-1α和Ang-2表达的影响*

张 芳张 波钱发才

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230061；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031）

脑梗死为临床常见致残和致死疾病，急性脑梗死为脑梗死常见类型，脑供血障碍和缺血缺氧造成脑组织坏死，系列神经症状，严重威胁生命健康，早期如何积极治疗是目前面临的重要问题［1-2］。急性脑梗死发病复杂，脑组织微血管与预后密切相关，目前临床治疗以抗血小板聚集、神经保护等对症治疗为主，临床疗效欠佳［3-4］。急性脑梗死属中医学“郁病”范畴，属临床常见的急危重症，脑部血脉为患，脑之血脉受邪，引起脏腑、经络生理功能失调，气血瘀滞而为病，治宜生血补气、疏肝解郁［5-6］。益血方由黄芪、当归等组成，对急性脑梗死具有较好的临床疗效，但其对血管新生的作用机制尚不明确。本研究以急性脑梗死大鼠为模型，旨在探讨益血方对急性脑梗死大鼠血管新生的作用机制及观察其对促血管生成因子低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和促血管生成素-2（Ang-2）表达的影响。现报告如上。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只SD大鼠，SPF级雄性，体质量（250±20） g，（25±2） ℃环境中 12 h 昼夜节律饲养，自由饮水进食，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2017-0011。

1.2 试药与仪器 益血方：黄芪15 g，当归10 g，川芎10 g，赤芍 15 g，丹参 15 g，柴胡 10 g，补骨脂 10 g，菟丝子20 g，枸杞子20 g，银杏叶 10 g，甘草10 g。 药材均为笔者所在医院中药房提供，制成生药含量1 g/mL的煎煮液。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）和白细胞介素-8（IL-8）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），HIF-1α和Ang-2试剂盒 （碧云天生物科技有限公司），尼莫地平（亚宝药业集团股份有限公司，批号：20170918），水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20171006）。切片刀和石蜡包埋机（浙江金华益迪试验器材有限公司），手术器械（上海金钟手术器械厂），低速离心机 （北京京立离心机有限公司），酶标仪（上海坤肯生物化工有限公司），显微镜（日本尼康公司）。

1.3 分组与造模 40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、益血方组和阳性组各10只。模型组、益血方组和阳性组大鼠采用改良自身线栓法制备急性脑梗死大鼠模型。水合氯麻醉大鼠，俯卧固定于手术台，剪开颈部右侧旁正中浅筋膜，暴露右侧颈总动脉和迷走神经，顿性分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，近心端结扎近端颈外动脉，微动脉夹住颈内动脉，0.3 mm尼龙线结扎固定颈总动脉，阻断大脑中动脉起始端血流，颈内动脉根部固定，防止线栓移动，消毒缝合皮肤。对照组采用假手术，进行线栓。术后6 h可自由进食。

1.4 给药方法 造模后第2天对照组和模型组给予生理盐水灌胃，益血方组给予益血方煎液灌胃，阳性组给予尼莫地平灌胃，剂量均为1 mL/kg，连续给药7 d后进行观察。

1.5 标本采集与检测 1）敞箱试验。给药1周后采用敞箱实验观察大鼠行为，将大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm四壁涂黑纸板箱底面，下记录3 min内大鼠正方形的数量、直立次数和修饰次数。2）脑组织病理组织观察。眼球取血处死动物，取脑组织，生理盐水清洗后，固定48 h后，二甲苯脱脂，酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察。3）免疫荧光染色测量脑微血管数量。大鼠麻醉后心脏灌注，脑组织冰冻切片，CD31免疫荧光染色，荧光显微镜观察微血管数量，选取皮层梗死灶周边4个区域观察。4）TTC染色法测量脑梗死面积。脑片平铺于2%TTC染色液中，避光孵育0.5 h，10%甲醛固定，梗死组织而呈白色，正常脑组织呈红色，通过Image-Pro Plus 6.0测量脑梗死面积。梗死百分比＝梗死区质量/（梗死区质量+非梗死区质量）×100%。5）TUNEL法检测神经细胞凋亡情况。切片脱蜡脱水，TUNEL试剂盒反应液和复合液，DAB显色，苏木素复染并封片，观察神经细胞凋亡情况。6）采集外周血，离心，取上清采用ELISA法测定外周血TNF-α、IL-2和IL-8细胞因子水平和HIF-1α和Ang-2水平，按说明书操作。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以n（%）表示，进行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组行为学评分比较 见表1。模型组水平、垂直和修饰次数评分均低于对照组，益血方组和阳性组水平、垂直和修饰次数行为学评分高于模型组 （P＜0.05），但益血方组和阳性组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组脑组织病理比较 见图1。对照组脑组织正常，未见异常，益血方组梗死灶内细胞和血管坏死，神经元肿胀，间质水肿，益血方组和阳性组脑组织少数神经细胞死亡，水肿减轻，神经细胞肿胀减轻。

表1 各组行为学评分比较（分，±s）

表1 各组行为学评分比较（分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.05。 下同

组 别 n 修饰次数水平得分 垂直得分对照组 10 7.39±1.02模型组 10 2.53±0.96△益血方组 10 4.72±1.12*△15.01±1.43 80.26±6.24 6.75±1.06△ 29.17±5.62△11.74±1.52*△ 63.41±6.89*△阳性组 10 5.06±1.22*△12.51±1.38*△ 64.10±7.05*△

图1 各组大鼠脑组织病理学切片（HE染色，200倍）

2.3 各组微血管密度、脑梗死百分比和神经细胞凋亡比较 见表2、图2和图3。对照组可见少量微血管，模型组微血管数量增多，益血方组和阳性组可见较多的微血管。模型组的微血管密度大于对照组，益血方组和阳性组微血管密度大于模型组（P<0.05），但益血方组和阳性组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组可见少量凋亡阳性细胞，模型组可见大量蓝黑色阳性细胞多，凋亡阳性细胞主要分布于皮层区，益血方组和阳性组凋亡阳性细胞减少。模型组的脑梗死体积和神经细胞凋亡高于对照组，益血方组和阳性组脑梗死体积和神经细胞凋亡低于模型组（P<0.05），但益血方组和阳性组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组大鼠脑微血管变化（免疫荧光染色，400倍）

图3 各组大鼠神经细胞凋亡TUNEL染色图（200倍）

表2 各组微血管密度、脑梗死百分比和细胞凋亡比较（±s）

表2 各组微血管密度、脑梗死百分比和细胞凋亡比较（±s）

组 别 n 神经细胞凋亡（个）微血管密度（个）脑梗死百分比（%）对照组 10 12.34±2.67模型组 10 61.27±6.81△益血方组 10 31.51±5.47*△5.42±1.25 0.00±0.00 9.21±1.35△ 26.78±2.62△14.74±2.02*△ 18.12±1.89*△阳性组 10 32.64±5.31*△13.67±1.79*△ 17.90±2.05*△

2.4 各组血清炎症因子水平比较 见表3。模型组血清TNF-α、IL-2和IL-8水平高于对照组，益血方组和阳性组血清TNF-α、IL-2和IL-8水平低于模型组（P<0.05），但益血方组和阳性组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组血清炎症因子水平比较（ng/mL，±s）

表3 各组血清炎症因子水平比较（ng/mL，±s）

组 别 n IL-8 TNF-α IL-2对照组 10 1.83±0.11模型组 10 4.57±0.27△益血方组 10 3.24±0.15*△34.17±4.91 3.51±0.21 65.42±6.42△ 5.84±0.42△46.38±5.33*△ 4.21±0.29*△阳性组 10 3.13±0.12*△45.13±5.41* 4.16±0.22*△

2.5 各组HIF-1α和Ang-2水平比较 见表4。模型组HIF-1α和Ang-2水平高于对照组，益血方组和阳性组HIF-1α和Ang-2水平高于模型组（P<0.05），但益血方组和阳性组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组 HIF-1α 和 Ang-2水平比较（ng/mL，±s）

表4 各组 HIF-1α 和 Ang-2水平比较（ng/mL，±s）

组 别 n HIF-1α Ang-2对照组 10模型组 10益血方组 10 14.36±2.67 12.14±11.31 46.37±3.42△ 40.14±24.22△21.56±2.33*△ 81.23±14.27*△阳性组 10 20.37±2.41*△ 80.65±14.11*△

3 讨 论

血管新生为脑梗死神经功能修复的重要机制，新生血管可加速缺血区侧支循环和组织营养物质的供给，改善局部血液供应，重塑受损脑组织结构，加速缺损神经功能修复［7］。HIF-1α为缺血缺氧调节因子，在缺氧条件下可调节多种基因，对急性脑梗死具有双重作用。HIF-1α有α和β亚基组成，在急性脑梗死发病中促进侧支循环生成，改善能量代谢，保护脑组织和神经细胞，在急性脑梗死治疗中，HIF-1α降低梗死面积，促进血管生成和微循环的形成及脑缺血半暗带细胞的功能，对中枢神经系统具有营养作用［8-9］。沈青等研究发现，HIF-1α参与了急性脑梗死疾病的发生发展过程，对疾病的严重程度和预后评估具有重要临床价值［10］。血管新生可促进血管通透性增加，Ang-2表达在血管内皮细胞表面，为分泌型的细胞因子，Ang-2表达过高，引起血管功能收缩，Ang-2水平降低，减少脑血管的收缩或痉挛，改善急性脑梗死血供，与预后密切相关［11-12］。

中医学认为急性脑梗死主症为气虚血瘀，治宜补气活血。气血之生成及血液畅行与五脏功能有关，益气通脉使之平衡协调，促进血脉生成。现代医家认为急性脑梗死为内因与外因共同结果，内因是发病基础，外因是发病导火索，脑部血脉为患，脑之血脉受邪，导致血脉脆而不坚，肝阳上亢，痰气引邪，气血冲逆，血液瘀滞，上犯于脑，引起窍络失利，气血运行不畅［13］。中医学中虽无血管新生的名称，益气活血类药物使闭塞的血管再通。近年来中医药促进血管新生的研究较多，惠振等研究发现，复方通络饮通过上调VEGF、Ang-1水平表达，促进脑梗死后微血管新生，对脑梗死大鼠具有保护作用［14］。冯容等发现龙蛭汤能促进气虚血瘀证脑梗死大鼠急性期神经功能恢复和缺血脑组织血管新生，其机制与上调促血管生成因子、HIF-1α和Ang-2水平相关［15］。

本研究发现，益血方组水平、垂直和修饰次数行为学评分升高，脑组织少数神经细胞死亡，水肿减轻，神经细胞肿胀减轻，微血管密度增加，脑梗死体积和神经细胞凋亡；TNF-α、IL-2 和 IL-8 水平降低，HIF-1α 和Ang-2水平升高。这是因为益血方中黄芪具有补气，活血通瘀的功效，当归、川芎、赤芍、丹参等活血止痛，化瘀活血不伤血。黄芪和丹参均具有降低血液黏度、拮抗血小板聚集、改善微循环等功效，当归能有效缓解缺血后再灌注损伤，其中含有的银杏黄酮苷和银杏内酯为强有力自由基清除剂，改善神经功能缺损，减轻缺血后脑水肿和炎症，减少脑梗死面积［16-17］。综上所述，益血方可改善急性脑梗死大鼠脑组织损伤，促进缺血脑组织血管新生，其机制可能与减轻炎症反应，上调HIF-1α和Ang-2表达有关。