猪圆环病毒3型感染BALB/c小鼠的实验观察

张超林，刘攀，沈萌，王妍，王娟，颜世君，严权斌，邓均华，孙哲，郭小参，王同燕，李向东*，田克恭,*

(1. 国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳 471003； 2. 普莱柯生物工程股份有限公司，河南洛阳 471000;3.河南农业大学牧医工程学院，郑州 410005)

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是单股闭合环状无囊膜的DNA 病毒，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，病毒粒子直径平均为17 nm，是迄今为止发现的最小动物病毒之一[1]。目前根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差异，将其划分为猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)[2]。PCV1最早在PK-15细胞中被发现，该病毒在细胞上不产生病变，也不会引起猪的发病，通常被认为是一种无致病性的细胞污染物，基因组全长1759 bp；PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，同时还与母猪繁殖障碍、猪皮炎与肾病综合征、猪坏死性及增生性肺炎等疾病密切相关，具有较强的致病性，基因组全长1768 bp或1767 bp[1-2]；PCV3最早于2016年，由Palinski等[3]在美国某商品化猪场发现并报道，PCV3基因组全长2000 bp，基因结构与PCV相似，同样包含3个主要开放阅读框。与 PCV3相关的疾病包括猪皮炎与肾病综合征、呼吸道疾病综合征，母猪繁殖障碍，仔猪心脏和多系统炎症、腹泻、先天性震颤等，而且在各个年龄阶段以及无明显临床发病症状的猪中均能检测到PCV3的存在，这就给临床确诊提高了难度，对疾病的预防和控制带来困难[3-13]。

猪对PCV2具有较强的易感性，该病毒可以水平传播，也可以垂直传播，目前世界各地规模化猪场普遍存在PCV2感染，给全球养猪业造成的巨大的经济损失[2]。自2016年美国报道PCV3以来，随后在中国、韩国、波兰、英国、意大利、丹麦、西班牙、巴西、瑞典和泰国等地陆续都报道存在该病[4-13]。目前对该病的研究还处于起始阶段，针对PCV3的预防和控制还处于探索阶段。目前，已有研究显示在中国的犬类中检测出PCV3阳性感染，而在鸭类中未检出PCV3[2,14]。对于鼠类是否感染PCV3尚未有报道，为了了解PCV3对小鼠的感染情况，本研究以临床检测为PCV3阳性的猪肺脏组织样品制备PCV3组织毒，将其感染BALB/c小鼠，观察其临床症状、剖检和病理变化，并通过血清学检测、荧光定量PCR检测和测序分析等方法分析PCV3感染情况，以期为PCV3的预防和控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级4～6周龄BALB/c雌性小鼠10只，体重18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2016-0011】。饲养于普莱柯生物工程股份有限公司【SYXK(豫)2013-0003】P2实验室+饲养间小型SPF实验动物设施IVC系统，所有小鼠均在已消毒的动物室中隔离饲养，采取自由饮水和采食。小鼠饲料购自北京科奥协力饲料有限公司。所有操作均符合实验动物伦理学要求【伦理审批号：AEEI-2018-031】。

1.1.2 PCV3阳性组织

猪源PCV3阳性组织由国家兽用药品工程技术研究中心保存。

1.1.3 主要试剂

Viral Nucleic Acid Extraction Kit购自中国Geneaid公司；荧光定量PCR试剂Probe qPCR Mix和高保真DNA 聚合酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 均购自日本TaKaRa公司；DNA 凝胶回收试剂盒购自美国Omega；2×Taq PCR MasterMix购自中国天根生化科技(北京)有限公司；TransScript II Reverse Transcriptase [M-MLV, RNaseH-](High Temperature RT)，Ribonuclease Inhibitor 和pEASY-Blunt Cloning Kit均购自中国北京全式金生物技术有限公司；胰蛋白胨(Tryptone)和酵母浸出液(Yeast Extract)均购自英国 Oxoid公司；HRP标记的羊抗鼠单抗购自美国Sigma Aldrich，PCV3 Cap蛋白由国家兽用药品工程技术研究中心制备和纯化，其他试剂为国产试剂。

1.1.4 主要仪器

荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；酶标仪购自美国Biotek公司；Mini台式离心机购自德国Eppendorf公司；PCR仪购自美国ABI公司；紫外透射分析仪购自其林贝尔公司；琼脂糖凝胶电泳仪购自美国Hoefer公司；紫外成像仪购自美国UVP公司；恒温培养箱购自德国MMM公司；循环水浴锅购自英国Prima公司；旋涡混合器购自美国Scientific Industries Inc；全封闭式组织脱水机、组织包埋机、半自动轮转切片机和摊片烤片一体机均购自美国Leica公司；空气浴震荡摇床购自美国NBS公司；恒温水浴锅购自中国上海一恒公司。

1.1.5 引物设计

参考文献中所述[15]，合成检测rep基因和CAP基因的引物，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，其序列如表1所示。

表1 检测用引物序列Table 1 Sequences of the primers used for detection

1.2 方法

1.2.1 PCV3组织毒的制备

选择PCV3阳性组织样品，称重后使用研磨器进行研磨，以1 g∶10 mL的比例加入灭菌PBS溶液，混匀后于-80℃冻融3次，经4℃、5000 g、10 min离心，收集上清，4℃、10 000 g、10 min离心，收集上清经0.22 μm滤器过滤分装，取样用Viral Nucleic Acid Extraction Kit制备核酸，使用TransScript II Reverse Transcriptase [M-MLV, RNaseH-](High Temperature RT)，Ribonuclease Inhibitor 和2× Taq PCR MasterMix进行外源病毒PCR或RT-PCR检测(包括猪圆环病毒Ⅰ型、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、乙脑病毒等)，外源病毒检测阴性的组织样品，于-80℃保存备用。

1.2.2 感染及试验设计

将10只BALB/c小鼠随机分为两组，实验组小鼠分别以0.1 mL/只滴鼻和0.5 mL/只腹腔注射感染PCV3组织毒(2.4×106拷贝)，对照组小鼠接种同样剂量的PBS溶液。两组小鼠分别饲养，均自由采食和饮水，感染开始前的时刻记为0 d，分别于感染后第0、3、7、11、14天经尾静脉采血。于感染后14 d对小鼠实施安乐死，剖检并采集组织样品。若实验中小鼠死亡，则立即剖检并采集组织样品。

1.2.3 临床症状、剖检病变及病理组织学观察

感染后每天早晚各观察一次，观察小鼠的临床症状。感染14 d后解剖小鼠并记录各组织器官的眼观病变。取心脏、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结组织， 4% 甲醛溶液固定，常规制备石蜡切片，HE染色，光镜观察组织病变。

1.2.4 血清及各组织含毒量检测

小鼠血清，以50 μL/样制备检测样品；观察组织病变情况，选择病变交界处称取0.2 g，放入研磨器中研磨，加入2 mL灭菌PBS，按照组织毒的制备方法制备样品，按照Viral Nucleic Acid Extraction Kit核酸提取试剂盒的说明书提取核酸。参考文献中PCV3荧光定量PCR检测方法[15]，使用REP基因检测引物扩增目的基因，构建标准质粒，建立标准曲线。按照Probe qPCR Mix试剂和BIO-RAD荧光定量PCR仪要求进行操作，反应条件：95℃，1 min；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40个循环，每个样品均进行三次重复检测。

1.2.5 阳性组织样品的测序分析

根据BALB/c小鼠各组织样品RT-QPCR检测结果，选择阳性样品核酸，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase、CAP基因测序引物进行扩展，胶回收PCR产物，将其克隆至pEASY-Blunt载体，选择阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司测序，使用DNAStar软件分析感染小鼠后病毒核酸序列是否发生变化。

1.2.6 血清抗体检测

使用PCV3 CAP蛋白包被96孔板，采用间接ELISA法对小鼠血清样品进行检测[16]，具体操作参考文献中所述，实验数据经Graphpad Prism5统计软件进行分析。

1.3 统计学分析

若数据服从正态分布，用独立样本t检验比较感染组组与对照组间的差异，若数据不服从正态分布， 则用非参数检验。统计软件采用 SPSS 16.0，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。

2 结果

2.1 临床症状及剖检病变

实验过程中对照组未观察到任何临床变化，被毛光泽，反应灵敏，饮食、饮水和活动均正常。感染组在感染后第3天有轻微精神沉郁，个别小鼠表现为不愿走动，其他未见有明显症状。剖检观察对照组和实验组小鼠组织器官基本正常，未看到明显变化。

2.2 病理组织学变化

组织病理检测结果显示对照组5只小鼠各组织器官未见明显病变。个别感染组小鼠在肺脏局部看见肺泡隔轻微增厚，肺泡上皮细胞增生(见图1A)；局部肺小叶边缘肺泡壁血管扩张淤血(见图1B)；淋巴结巨噬细胞内可见吞噬有少量崩解坏死的淋巴细胞碎片(见图1C)，其他组织无明显变化。

2.3 血清和各组织病毒含量检测结果

根据检测方法判断标准，以Ct值>36判为阴性，血清样品检测结果说明，PCV3感染小鼠3 d血清样品检测为阳性，1只小鼠7 d血清样品检测为阴性，11、14 d样品检测为阴性(表2)。各组织中病毒含量检测结果如表3所示，感染后14 d小鼠的心脏、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结组织均能检测到病毒，其中以肝的病毒含量最高，其次为脾，其他组织中病毒含量较低。

分组Groups 编号Numbers0 d3 d7 d11 d14 d病毒感染组 Infected group1#-33.77 ± 0.2135.58 ± 0.3138.22 ± 0.2638.22 ± 0.262#-34.49 ± 0.2535.67 ± 0.3138.02 ± 0.3038.02 ± 0.303#-34.59 ± 0.2536.71 ± 0.2538.99 ± 0.2538.99 ± 0.154#-33.94 ± 0.2033.67 ± 0.3636.17 ± 0.3636.47 ± 0.325#-33.57 ± 0.2034.70 ± 0.3135.94 ± 0.3137.07 ± 0.15空白对照组 Control group6#-----7#-----8#-----9#-----10#-----

表3 BALB/c小鼠感染PCV3后各脏器荧光定量PCR检测结果Table 3 Results of quantitative fluorescence RT-PCR detection of PCV3 in different organs of BALB/c mice after PCV3

2.4 BALB/c小鼠PCV3阳性组织样品克隆测序

选择肝和脾核酸样品，分别扩增PCV3 CAP基因，对其进行测序分析，结果图2所示，在小鼠肝和脾中的PCV3 序列与猪组织中PCV3序列相同，未发生变化。

注：PCV3-Porcine-ORF2，猪组织样品中PCV3 CAP序列；PCV3-Mice Liver ORF2，感染小鼠肝中PCV3 CAP序列；PCV3-mice spleen ORF2，感染小鼠脾中PCV3 CAP序列。图2 PCV3 CAP基因序列分析Note. PCV3-Porcine-ORF2: The sequence of PCV3 CAP in pig tissue sample. PCV3-Mice Liver ORF2: The sequence of PCV3 CAP in the liver tissue of infected mice. PCV3-mice spleen ORF2: The sequence of PCV3 CAP in the spleen tissue of infected mice.Figure 2 MegAlign analysis of the PCV3 CAP gene sequencies

2.5 血清抗体检测结果

如图3所示，经ELISA检测小鼠血清抗体，对照组小鼠在整个试验过程中，血清抗体均保持阴性。PCV3感染组小鼠在感染后第3天血清中开始出现抗体阳性，但此时抗体水平较低，在感染后第7天抗体阳性率显著升高，随后血清抗体水平逐渐升高。

图3 间接ELISA检测小鼠血清抗体Figure 3 Detection of PCV3 antibodies in the serum of mice by indirect ELISA

3 讨论

自2016年美国首次发现并报道PCV3以来，在世界各地多个国家的猪群中陆续报道了PCV3的存在，而且与猪皮炎与肾病综合征、呼吸道疾病综合征，母猪繁殖障碍，仔猪心脏和多系统炎症、腹泻、先天性震颤等疾病的发生可能相关[3-13]，对养猪业的发展造成了巨大的经济损失。近期有学者报道在中国犬类中检测到感染PCV3的研究，针对PCV3防控受到越来越多的关注。目前，市场上还未有针对PCV3的疫苗，也未发现合适的药物用于预防和治疗该病。为了有效地控制该病，预防和控制传播源，切断传播途径是根本，提高猪场生物安全防护，加强猪群免疫水平有利于对疾病的防控。此外，简便，快速有效的检测技术是防控疾病的保障。

本研究中显示PCV3组织毒感染小鼠不引起明显的临床症状和病理变化，但可以在小鼠血清和多个组织中检测到病原存在，说明PCV3可以感染小鼠。在本次研究中，PCV3感染小鼠并不引起明显临床症状，可能跟病毒剂量较低和毒力较弱相关。组织病理观察结果显示在个别小鼠局部肺小叶边缘有肺泡壁血管扩张淤血，可能是发病所致，但也不排除实验过程中操作原因造成的局部淤血。荧光定量PCR检测结果显示，在感染早期可以在血清中检测到PCV3，随后血清中病毒含量有下降的趋势；在小鼠肝和脾中病毒含量较高，其他组织中相对较少，因此针对该病的检测，应在感染早期取样，优选小鼠肝和脾样品进行检测。

本研究结果显示PCV3组织毒可以感染BALB/c小鼠，虽然不表现明显症状，但小鼠可以携带病毒，因此灭鼠是预防PCV3流行的一个重要影响因素。