周脂素在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达

卫兵艳，樊林花，刘茂林，轩瑞晶，刘田福

(山西医科大学实验动物中心，实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，太原 030001)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是以血糖升高为主要特征的代谢综合征，长期持续的高血糖会引发多种并发症，当高血糖累及肾微血管时，出现糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，DN是导致DM患者出现慢性肾功能衰竭(chronic renal failure， CRF)的最主要原因，也是导致DM患者死亡的首要原因之一[1]。 据报道，DM患者每年约有10%死于CRF[2]。DN在早期治疗效果较好，一旦错过最佳治疗时间，将会由大量尿蛋白而发展至尿毒症(uremia)、CRF以至危及患者的生命。故早期诊断DN、明确其发病机制对于预防和治疗DN有很重要的临床意义。

层粘连蛋白(laminin，LN)是一种非胶原糖蛋白，表达区域集中在肾小球系膜基质区。有研究发现DM患者还未出现肾病表现时，尿LN就有升高，出现肾病时有明显升高[3]。因此，检测尿LN有助于DN的诊断。周脂素(perilipin，Plin)也称脂滴相关蛋白，与胰岛素抵抗及脂代谢异常有密切的关系，其在DM大鼠的肝脏中表达增高[4]，而目前就Plin在DN中研究尚未见报道。本实验通过制作DN大鼠模型，观察尿LN对早期DN的诊断价值，同时重点研究Plin在DN模型中的表达情况，为进一步明确DN发病机制寻找新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠14只，8～10周龄，体重(200 ± 20)g，购自山西医科大学实验动物中心【SCXK(晋)2015-0001】，饲养于山西医科大学实验动物中心SPF级环境中【SYXK(晋)2015-0001】。实验操作过程中符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：IACUC2018-002)。

1.1.2 试剂及仪器

高糖高脂饲料(北京科澳力饲料有限公司，D12450B)，链脲佐菌素(streptozotocin, STZ, Sigma，S0130)，考马斯亮蓝染料(Bio-Rad，1610786)，尿LN ELISA 试剂盒(Nanjing Senbeijia Biotechnology Co. Ltd.，G01012078)，EastepTMSuper Total RNA Extraction Kit(Promega，LS1040)，GoScript Reverse Transcription Mix Oligo(dT)(Promega，A2790)，GoTaq Gpcr Master Mix(Promega，A6002)，Plin抗体(Abcam，ab66514)，Plin及β-actin引物由大连TaKaRa 公司合成。

荧光定量PCR仪(QuantStudio 6 Flex，ABI，美国)，酶标仪(Epoch，BioTek，美国)，血糖仪及试纸(ACCU-CHEK，Roche，美国)，显微镜(BX51，Olympus，日本)，化学发光成像仪(G-Box，Chemi XX9, Syngene，英国),麻醉机(I-21025 Comerio，Ugo Basile S.R.L，意大利)。

1.2 方法

1.2.1 制作DN大鼠模型

配置1%的STZ溶液：称取1 g的STZ溶于100 mL新配制的0.2% 构椽酸盐缓冲液中,充分溶解后待用。

14只雄性SD大鼠进行随机分组，对照组6只，喂饲普通维持饲料，模型组8只，喂饲高糖高脂饲料，在SPF环境持续饲养28 d，于第28天晚上7点开始空食，12 h后模型组腹腔注射1% STZ(30 mg/kg)，对照组腹腔注射等剂量构椽酸盐缓冲液。2 d后刺尾使用血糖试纸检测血糖，血糖值≥ 16.7 mmol/L，且出现多饮、多食、多尿症状的即DM大鼠模型制作成功。继续维持饲养42 d，并监测24 h尿蛋白(每周1次)，当24 h尿蛋白≥30 mg/kg，即DN大鼠模型制作成功。

1.2.2 尿液相关指标的检测

从第5周开始，每周固定留取一次24 h尿标本，记录每次尿量，然后取5 mL，离心后，取上清测量尿蛋白。空白管加50 μL蒸馏水、标准管加50 μL标准蛋白、样品管加50 μL的上清，每孔再各加3 mL 考马斯亮蓝 (Coomassie brilliant blue, CBB)，静置5～10 min，595 nm测吸光度值。根据公式计算：尿蛋白浓度=(样品管吸光度值/标准管吸光度值)×标准蛋白浓度。

尿LN测定：设空白孔、标准孔、样品孔；标准品按倍比稀释后各加50 μL，取50 μL尿液上清加入样品孔；封板膜封板后，37℃，30 min；揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加350 μL洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干；每孔加酶标试剂50 μL，37℃，30 min；弃液，加350 μL洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干；加显色剂A 50 μL，再加显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光，10 min；加终止液50 μL(此时蓝色立转黄色)；15 min以内酶标仪上空白孔调零，450 nm波长测OD值；根据标准曲线计算样品浓度。

1.2.3 肾组织的处理

每只鼠称重后，2.5%异氟烷面罩吸入麻醉，仰面固定，剪开腹部，摘下左右两肾。所有大鼠均选左侧肾进行称量，记录重量，之后放入装有4%中性甲醛离心管中进行固定，48 h后进行石蜡包埋，切片，HE染色。右肾投入液氮灌中冻存，用于后续的RNA和蛋白提取。

1.2.4 Real-time PCR检测肾组织Plin mRNA水平的表达

依照EastepTMSuper Total RNA Extraction Kit说明，取冻存肾皮质约20 mg，提取RNA，酶标仪上检测RNA的浓度计纯度后，按照GoScript Reverse Transcription Mix Oligo (dT)说明进行反转录。最后按照GoTaq Gpcr Master Mix的说明进行qPCR，每个样本重复3次。所用Plin引物为：Forward primer：5,-CGAGTCACAACCCCACGAT-3,Reverse primer:5,-TCAGCCCAGAGAGGAA-3,。反应体系：Forward / Reverse primer 0.4 μL、RNA 2 μL、Mix 10 μL、CXR 0.2 μL、ddH2O 7 μL，总体积 20 μL。反应条件：95℃10 min，95℃15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。

1.2.5 Western blot 检测肾组织中Plin蛋白的表达

提取肾组织总蛋白，BCA 法定量，加入loading buffer后煮蛋白变性，进行SDS-PAGE电泳，之后进行湿法转膜将蛋白条带转移至PVDF膜上，然后洗膜，封闭，一抗孵育过夜(4℃，80 r/min)，二抗孵育1 h(80 r/min)，PBST洗3次膜之后进行显影。DAB显色剂显影，ImageJ软件对WB条带定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组大鼠体重、肾重、肾重/体重的结果

将每只大鼠的肾重量和体重进行比值发现：模型组的肾重/体重明显高于对照组的大鼠，差异有显著性(P< 0.05)。另外，对比对照组，模型组的大鼠体重明显降低，差异有显著性(P< 0.05)，结果见表1。

2.2 两组大鼠的尿量、24 h尿蛋白以及尿层粘连蛋白的变化情况

通过对比发现：相比对照组，在第5周时，模型组的尿量和尿LN已经明显升高，差异有显著性(P< 0.05)，24 h尿蛋白在6周时开始出现明显增高，差异有显著性(P<0.05)。并且，尿中的这三项指标随时间推移都呈上升趋势，结果见表2，图1。

表1 两组大鼠体重、肾重及肾重/体重的结果Table 1 Body weight, kidney weight and kidney-to-body weight ratios of the two rat

注：和对照组比较，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05.

表2 两组大鼠尿量、层粘连蛋白、尿蛋白的变化情况Table 2 Changes of urine volume, laminin and protein content in the two rat groups

注：和对照组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05，**P< 0.01。

图1 两组大鼠的尿量、尿层粘连蛋白以及24 h尿蛋白的变化Figure 1 Changes in urine volume,laminin and 24-hour urinary protein levels in the two rat groups

2.3 肾病理改变

HE染色结果显示:模型组大鼠肾出现典型的病理改变，肾小球肥大,系膜增生，有微小血管瘤形成。肾小管管腔变形，管腔内散在有脱落的上皮细胞，间质内有纤维组织增生，还可见单核、淋巴等炎症细胞浸润，见图2。

图2 大鼠肾组织的病理改变(×200) Figure 2 Pathological changes of kidney tissues (H&E staining, ×200)

2.4 肾组织Plin mRNA的检测结果

模型组肾组织Plin的mRNA表达明显升高，是对照组的(3.26 ± 0.37)倍，差异有显著性(P< 0.05)，见图 3。

图3 大鼠肾Plin的qPCR检测结果Figure 3 Expression of Plin mRNA in the rat kidneys detected by qPCR

2.5 两组大鼠肾组织Plin蛋白Western blot检测结果

模型组Plin蛋白表达明显升高，是对照组的(2.98 ± 0.59)倍，差异有显著性(P<0.05)，见图 4。

图4 两组大鼠肾组织Plin蛋白表达情况Figure 4 Expression of Plin protein in the rat kidneys

3 讨论

糖尿病肾病作为引起终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)主要病因[5]，对人类生命健康构成了很大的威胁。其主要病理改变特点是微血管内皮细胞损伤导致基膜增厚，血管阻塞引起组织缺氧，继而肾小球硬化、肾间质纤维化，最终导致CRF。其发病机制也较复杂，涉及肾小球血流动力学改变、生化代谢紊乱、氧化应激、细胞因子与遗传易感性等多种因素,但其确切的发病机制尚未能完全阐明[6]。

对于DN大鼠模型的制作，目前最常使用单侧肾动脉结扎+高糖高脂饲料喂养 +小剂量STZ腹腔注射的三联法[7]，该方法造模时间短，但有创伤性，手术本身对大鼠的发病过程存在影响。本研究通过高糖、高脂饲料诱导大鼠的胰岛素出现抵抗，再给予小剂量SZT破坏胰岛细胞，这样就可以达到仅出现胰岛素分泌障碍，而不是不分泌胰岛素的目的，很好的模拟了II型DM的发病过程[8]。在此基础上持续高脂饲料喂养使其病变继续发展，直至出现肾损害，达到DN病变。很好的模拟了DN的发生发展过程，但造模周期较长。造模结果显示DN组大鼠的肾重/体重比明显增高，24 h尿蛋白增高，HE染色出现典型的病理改变等，证明模型制作成功。

尿层粘连蛋白是ECM的主要成分，在肾小球间质纤维化中表达增高[3]，实验结果显示模型组大鼠的尿LN增高比尿蛋白出现早，且随时间的推移不断升高。LN的分子量为900×103，属于大分子物质，DN早期肾小球滤过率增加，LN排除增加，且DM持续的高血糖刺激肾血管上皮细胞合成LN增多[9]，DN早期LN增高的原因在于肾排除及合成LN增多。因此，尿LN能较早的反应DN肾ECM的变化，对DN的早期诊断有很好的警示作用。

Plin包被在细胞脂滴表面，对脂肪调节具有双重作用，主要通过双向调节脂滴内中性脂肪的水解来实现细胞内脂质的平衡：当细胞需要能量供应时，促进中性脂肪水解，能量充足时，则抑制脂肪水解，防止因过量脂肪酸堆积而引起脂毒性损伤[10]。另外，雌激素也能通过抑制Plin来减少肝细胞内的脂质沉积[11]。糖脂代谢异常往往相伴发生，故越来越多的学者开始研究Plin在糖代谢方面的作用，在糖代谢异常大鼠模型的肝脏组织中Plin表达增高，其可能促进了糖代谢异常合并非酒精性脂肪肝的发生[12]。在小鼠糖耐量模型中，Plin能够降低心脏的氧化应激反应进而使微血管内皮细胞的凋亡率降低[13]。这些研究结果提示Plin可能在DM 的并发症DN中也发挥着一定的作用，故本实验通过对DN模型大鼠肾组织Plin表达水平进行检测发现，Plin的mRNA及蛋白表达均有明显的增加，说明DN的发生和Plin的高表达有关，详细机制还需要做进一步的研究。