黄芪甲苷预处理对大鼠肠缺血再灌注损伤的影响

任晓静，杨 涛，耿立成

缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）导致的肠损伤是创伤、脓毒症及腹部大手术等的严重并发症，是围手术期重症患者死亡的主要因素之一[1]。炎症反应、氧化应激、肠黏膜细胞凋亡及紧密连接破坏在肠I/R损伤的发生及进展中扮演重要的角色[2]。多项研究表明，黄芪甲苷（astragaloside IV, AS-IV）对I/R导致的脑、心肌、肝、肺等器官损伤均具有明确的保护作用[3-6]，然而AS-IV对I/R所致肠损伤的作用尚未见报道。本实验研究拟通过建立大鼠肠I/R损伤的动物模型，探讨AS-IV在调节肠I/R损伤中的治疗保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年雄性SPF级、体质量180～220 g的Wistar大鼠，购于军事医学科学院实验动物中心。

1.1.2 主要药物与试剂 AS-IV（批号170302）购自南京森贝伽生物科技有限公司；TNF-α、HMGB-1、SOD和CAT的ELISA试剂盒全部购自 美 国 R&D公 司。Bcl-2、Bax、Caspase-9及GAPDH的引物由上海生工生物工程有限公司合成，反转录试剂盒购自德国Roche公司，荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司。小鼠抗occludin单克隆抗体、兔抗ZO-1单克隆抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体均购自英国Abcam公司。

1.1.3 主要仪器设备 高速低温离心机（日本Kubota公司）；ST-360酶标仪（上海科华实验系统有限公司）；正置光学显微镜（德国Carl Zeiss公司）；荧光定量PCR仪（Thermo公司，美国）；SDS-PAGE凝胶电泳系统及全自动凝胶成像-分析系统（Bio-Rad公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 按照随机数字表法将30只Wistar大鼠随机分为3组：假手术（Sham）组、模型（I/R）组、AS-IV预处理（AS-IV）组，每组10只。适应性饲养7 d，AS-IV组于造模前60 min时，使用浓度剂量为60 mg/kg的AS-IV对大鼠进行灌胃预处理；Sham组和I/R组给予等体积的生理盐水灌胃预处理。

1.2.2 模型制备 按照参照文献[7]制备大鼠肠I/R损伤模型。大鼠于术前禁食12 h，自由饮水，按照300 mg/kg标准给与大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰卧位固定于动物手术台。按照无菌操作原则，经腹正中切口，寻找并分离肠系膜上动脉（superior mesenteric artery，SMA），无创微动脉夹夹闭SMA，观察到SMA搏动消失且肠壁色泽变苍白的同时开始肠缺血计时；缺血60 min后松开动脉夹，恢复血流灌注，肉眼可见肠系膜动脉搏动恢复，小肠组织颜色由暗红变为鲜红，表明再灌注成功。回纳血管，关闭腹腔。其中，I/R组和AS-IV组按照上述方法建立模型，Sham组仅分离SMA而不夹闭。各组于再灌注120 min时，分别取血及小肠组织进行各项指标的测定。

1.2.3 炎症因子及抗氧化酶的测定 于再灌注120 min时，大鼠心尖处穿刺采集血样，4 ℃静置30 min，4 ℃离心10 min（3×103转/min，离心半径10 cm），收集上清。运用ST-360酶标仪，采用ELISA法检测上清液中TNF-α、HMGB-1、SOD和CAT的水平，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.2.4 小肠组织染色及病理评分 血样采集完毕后立即处死大鼠，取距离回盲瓣约5 cm处肠段1 cm，10%多聚甲醛固定。小肠组织常规石蜡包埋、切片后HE染色，光镜下（×100）观察小肠组织病理学变化情况，并行Chiu评分，随机选取5个视野，取其平均值。

1.2.5 凋亡分子mRNA的测定 另取距回盲瓣6 cm处的肠段1 cm，放入匀浆器，加入TRIZOL溶液1 mL，多次研磨将组织磨成匀浆，使细胞完全裂解，提取小肠组织样本中的总RNA，测定其含量和纯度。运用cDNA反转录试剂盒逆转录合成cDNA。以总RNA 1 μg为模板，总反应体系为20 μL。反应条件：25 ℃预热10 min，55 ℃反转录30 min，85℃ 5 min使反转录酶失活。所合成的cDNA置于-20 ℃条件下保存。Bcl-2、Bax、Caspase-9及 GAPDH引 物 由 上海生工生物工程有限公司合成。Bcl-2的上游引物：5’-GCTACGA GTGGGATACTGGAGA-3’，下游引物：5’-GAACTCAAAGAAGGCCACAATC-3’，引物长度 371 bp。Bax的 上游引物：5’-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3’， 下游引物：5’-TGAGGAC TCCAGCCACAAA-3’，引物长度377 bp。Caspase-9的上游引物：5’-AGCCAGATGCTGTCCCATAC-3’， 下游引物：5’-CAG GAGACAAAACCTGGGAA-3’，引物长度593 bp。GAPDH的上游引物：5’-AACAGCAACTC CCACTCTTC-3’， 下游引物：5’-CCTCTCTTGCTCAGTGTCCT-3’， 产 物长度252 bp。运用荧光定量试剂盒进行PCR扩增，反应体系25 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40个循环。应用荧光定量PCR仪，运用2-△△CT法对Bcl-2、Bax和Caspase-9的mRNA水平进行相对定量分析。

1.2.6 紧密连接蛋白的测定 另取距回盲瓣7 cm处的肠段10 cm，充分匀浆裂解，4 ℃离心10 min（1×104r/min，离心半径10 cm）。收集上清，BCA法测定蛋白浓度。于10% SDS-PAGE凝胶泳道中上样电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入以下一抗：小鼠抗occludin单克隆抗体（稀释度1:1000）、兔抗ZO-1单克隆抗体（稀释度1:1000）和小鼠抗β-actin单克隆抗体（稀释度1:2000），4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（稀释度1:1000）室温孵育2 h。洗膜后在暗室中加入增强化学发光液，运用全自动凝胶成像-分析系统进行阳性信号检测及分析，以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

1.2.7 统计学分析与处理 本研究所有数据运用SPSS 21.0统计学软件进行分析。计量资料先采用Shapiro-Wilk法检验判断数据是否为正态分布，所有数据均呈正态分布且方差齐性，以均数±标准差（）的形式表示。组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS-IV预处理对大鼠小肠组织病理学变化的影响 与Sham组比较，I/R组的小肠组织病理学Chiu评分显著升高（P＜0.05）；与I/R组比较，AS-IV组的小肠组织病理学Chiu评分显著降低（P＜0.05），见图 1、表 1。

表1 大鼠再灌注120 min时小肠组织Chiu评分

2.2 AS-IV预处理对大鼠炎症因子和抗氧化酶的影响 与Sham组比较，I/R组TNF-α和HMGB-1的水平显著升高，SOD和CAT的水平显著降低（P＜0.05）；与I/R组比较，AS-IV组TNF-α和HMGB-1的水平显著降低，SOD和CAT的水平显著升高（P＜0.05），见表2。

2.3 AS-IV预处理对大鼠小肠组织凋亡相关分子mRNA水平的影响 与Sham组比较，I/R组Bcl-2、Bax和Caspase-9的mRNA水平显著升高（P＜0.05）；与I/R组比较，AS-IV组Bcl-2、Bax和Caspase-9的mRNA水平显著降低（P＜0.05），见表3。

表2 三组大鼠再灌注120 min时，炎症因子与抗氧化酶水平

表3 三组大鼠再灌注120 min时，凋亡相关分子mRNA水平

2.4 AS-IV预处理对大鼠小肠组织中occludin和ZO-1的表达水平的影响 与Sham组比较，I/R组occludin和ZO-1的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与I/R组比较，AS-IV组occludin和ZO-1的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），见图2、表4。

图2 三组大鼠再灌注120 min时，Western blotting法测定ZO-1和occludin蛋白表达情况

表4 三组大鼠再灌注120 min时，ZO-1和occludin蛋白表达水平（n=10，）

表4 三组大鼠再灌注120 min时，ZO-1和occludin蛋白表达水平（n=10，）

注：a与Sham组比较，P＜0.05；b与I/R组比较，P＜0.05

组别 n occludin ZO-1 Sham 组 10 1.082±0.131 0.891±0.068 I/R 组 10 0.235±0.037a 0.138±0.022a AS-IV 组 10 0.593±0.096b 0.635±0.054b

3 讨论

肠I/R损伤是创伤、脓毒症及肠移植、腹主动脉瘤等大手术的常见严重并发症，较高的发病率与死亡率是此类重症患者死亡的主要原因之一[1,8]。本研究通过分离并夹闭SMA 60 min后再灌注120 min建立肠I/R大鼠模型，研究黄芪甲苷预处理对大鼠肠缺血再灌注损伤的影响。

AS-IV是由黄芪中所提取出的一种高纯度药物成分。黄芪成分非常复杂，其主要活性成分为黄芪多糖，而后者的主要有效成分则为多糖和黄芪苷[9]。黄芪苷可分为三类：黄芪苷Ⅰ、黄芪苷Ⅱ、黄芪苷IV。其中，黄芪苷IV生物活性最佳，即AS-IV[10]。参考文献报道[3-6]，本实验选择浓度剂量为60 mg/kg的AS-IV对大鼠进行灌胃预处理，结果表明，肠I/R模型的小肠组织Chiu评分显著升高，表明大鼠肠I/R损伤模型成功建立；而AS-IV预处理能够显著降低小肠组织的Chiu评分，证实该AS-IV预处理方案对肠I/R损伤具有确切的保护效应。

多重伤害性因素，如大量氧自由基生成、炎性介质过度释放、肠上皮细胞异常凋亡、紧密连接破坏等因素均参与肠I/R损伤的发生与进展过程。本研究首先通过测定炎性因子释放水平从而反映炎症反应程度[2]。本研究结果表明，AS-IV预处理能够有效减轻TNF-α与IL-1β水平的过度表达，提示AS-IV减轻肠I/R损伤的作用可能与抗炎作用有关。本研究进一步通过测定抗氧化酶反映氧化应激水平，通过测定凋亡相关分子的mRNA水平从而反映细胞凋亡程度，发现AS-IV预处理能够显著缓解肠I/R所致SOD和CAT的低表达，降低I/R所致的Bcl-2、Bax和Caspase-9的高mRNA表达，提示AS-IV对肠I/R损伤的保护作用可能与抗氧化、抗凋亡作用有关。

紧密连接位于肠道黏膜上皮细胞膜边缘，使得肠上皮细胞彼此之间的间隙处于可控制的密封状态，是肠屏障的重要组成部分[11]。ZO-1和occludin是紧密连接的主要成员，因此本研究通过测定上述两种分子的蛋白表达水平，从而反映紧密连接的完整性。AS-IV预处理能够显著减轻肠I/R所致的ZO-1和occludin蛋白表达下调，提示AS-IV治疗肠I/R损伤的作用可能与缓解紧密连接受损有关。

综上所述，AS-IV灌胃预处理能够显著改善大鼠肠I/R损伤，其机制可能与减轻机体炎症反应和氧化应激水平、抑制肠道细胞的凋亡发生以及调节紧密连接蛋白表达有关。