盘状大同源物5在肺腺癌中的表达及其临床意义

车娟娟，甄洪超，王 婧，李卉惠，曹邦伟

肺癌是全世界发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，其五年生存率仅为15.9%[1]。按照病理学类型可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），肺鳞癌和肺腺癌是NSCLC的主要病理类型，其中肺腺癌的发病率逐年升高，尽管近几年肺腺癌的诊疗手段不断进步，但大多数肺腺癌患者发现时已是晚期，治疗效果不佳，预后较差。因此，探索发现影响肺腺癌预后的生物标志物非常重要。

DLG5是膜相关鸟苷酸激酶家族的新成员[2]，DLG5是一种多功能调节和支架蛋白，可以与多种蛋白质结合，包括β-catenin、p55、KIF20A、突触结合蛋白4和枸橼酸激酶[2-5]。DLG5在肺叶正常发育和肺泡祖细胞分化中起重要作用[6]。研究发现DLG5在多种肿瘤组织中表达下调，包括肝癌、前列腺癌、胰腺癌和膀胱癌[2-4,6]。研究发现DLG5可以抑制肾上皮细胞和前列腺癌细胞的上皮间质转化（EMT）[5,7]。目前DLG5在肺腺癌中的研究非常少。

本研究应用免疫组化SP法检测122例肺腺癌组织中DLG5的表达情况，并运用Western blotting法检测20对肺腺癌和癌旁正常肺组织中DLG5的表达情况，并进行相关因素分析和预后分析，探讨DLG5在肺腺癌中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例收集：收集首都医科大学附属北京友谊医院2008年1月—2012年1月手术切除的肺腺癌石蜡包埋标本122例，请高年资的病理医师复习病理切片。

病例入选标准：（1）术前行胸部CT扫描、脑CT或MR扫描、腹部CT扫描，排除肝、全脑、双侧肾上腺、对侧肺内无转移，全身ECT骨扫描检查（部分患者行PET-CT检查）排除骨转移的患者；（2）术前未接受任何放、化疗等抗癌治疗；（3）依据NCCN指南要求，行肺癌根治性切除术及随访资料完整患者为研究对象，排除术后1月内死亡病例。

治疗方式：所有患者均经手术治疗，并且给予患者手术为主的综合治疗，ⅢA期患者术后予以辅助化疗，部分ⅢA期患者行辅助放疗。其中化疗采用NSCLC的常规方案，包括培美曲塞联合顺铂或卡铂（PP）、紫杉醇联合顺铂或卡铂（TP）、多西他赛联合顺铂或卡铂（TP）。

1.2 免疫组化检测方法 采用免疫组化SP法对所有标本中的DLG5蛋白表达情况进行检测，具体方法：4 μm厚的组织切片常规脱蜡、梯度乙醇入水。应用3%的H2O2避光室温放置20 min封闭内源性过氧化物酶活性，使用0.1%枸橼酸缓冲液（pH 6.0）高温高压修复抗原后，滴加10%正常山羊血清反应20 min，加DLG 5一抗（1:100稀释，Assay Biotech，Sunnyvale，CA，USA），4 ℃过夜后，加入生物素标记的二抗，在37 ℃孵育30 min，二甲基联苯胺（DAB）显色。封固后在光学显微镜下观察染色结果。以前列腺癌组织染色结果作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。进行免疫组化染色的标本选取病理切片中整个视野均为肿瘤细胞且细胞形态结构完整的区域。

免疫组化着色结果判断DLG5阳性表达定位于细胞膜。免疫组化反应根据染色强度和阳性细胞百分比分级为0～3级。0 分：没有着色或者阳性细胞小于10%；1分：大于10%的肿瘤细胞浅着色或者10%～40%的细胞中等着色；2分：大于40%的肿瘤细胞中等着色或者10%～40%的肿瘤细胞强着色；3分：大于40%的细胞强着色。为了便于统计分析，将0～1分者定义为阴性组，将2～3分者定义为阳性组。

1.3 Western blotting检测方法 取出-80 ℃冻存的组织标本，切取绿豆粒大小的组织标本（肺腺癌组织和癌旁肺组织）；将要提取总蛋白的组织标本利用液氮、研钵粉碎呈粉末状后后移入1.5 mL的EP管中，加入RIPA裂解液，提取组织总蛋白并进行蛋白定量。进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白质湿转至PVDF膜上，5%BSA封闭2 h后，加入DLG5（1:1000 dilution，Abcam，Cambridge，MA，USA）一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，每次8 min，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗3次，每次8 min，然后ECL显影。

1.4 统计方法及随访 应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，率的检验采用χ2检验，Kaplan-Meier法计算生存率，Log-rank检验进行单因素分析，多因素分析利用Cox回归模型进行，以P＜0.05为差异有统计学意义。生存时间定义为：自手术治疗之日至末次随访日或死亡的时间，以年为单位计算。失访或随访截止时仍存活者视为截尾数据，随访终止日期为2017年1月1日。

2 结果

2.1 DLG5在肺腺癌中的表达情况及与临床特征的关系 免疫组化法检测DLG5表达如图1，DLG5阳性表达定位于细胞膜上。122例肺腺癌的基本临床病理特征如表1。分析122例患者中，DLG5表达与性别、年龄、吸烟史、T分期无相关性，而与淋巴结转移（P=0.003）、TNM分期（P=0.003）及复发转移（P=0.000）相关，结果如表2所示。I期肺腺癌患者DLG5阳性表达率明显高于ⅢA期患者。

图1 免疫组化检测DLG5在肺腺癌组织表达情况

表1 肺腺癌患者临床病理资料情况

表2 122例肺腺癌标本中DLG5阳性表达与临床因素的关系

2.2 DLG5在肺腺癌和癌旁肺组织中的表达情况 运用Western blotting方法随机检测20对肺腺癌和癌旁组织中DLG5的表达情况，并进行三次实验重复验证，结果显示DLG5在肺腺癌中的阳性表达率明显低于癌旁组织（T代表肿瘤，N代表癌旁组织），随机选取其中四对标本的结果如图2（灰度值标识于图2）所示。

图2 Western blot检测肺腺癌和癌旁组织中DLG5的表达情况

2.3 DLG5在肺腺癌组织中的表达及与预后的关系 患者总体中位生存期为51.0个月，95%CI（34.526，67.474），1、2和5年生存率分别为83.6%、65.5%和43.9%。DLG5表达阴性的患者，中位生存期明显短于表达阳性的患者（20.0个月vs 67.0个月），差异有统计学意义（χ2=8.522，P=0.004)。

2.4 患者生存的预后因素分析 应用Kaplan-Meier法对122例肺腺癌患者相关因素进行单因素分析显示：性别、年龄、吸烟史对患者生存率的影响无统计学意义（P＞0.05）。而DLG5、T分期及TNM分期对患者生存率的影响有明显统计学意义（P＜0.05）（如表3）。

表3 肺腺癌患者的预后因素的单因素分析结果

对上述进行单因素分析的因素，包括年龄、性别、吸烟史、T分期、N分期、TNM分期以及DLG5的表达，纳入Cox回归模型，行多因素分析显示：DLG5（P=0.000）和TNM分期（P=0.018）是肺腺癌独立的预后影响因素，其生存曲线分别如图3、图4和表4所示。

图3 肺腺癌患者中不同DLG5表达的生存曲线

图4 不同TNM分期肺腺癌患者的生存曲线

表4 肺腺癌患者的预后因素的多因素分析结果

3 讨论

盘状大同源物5（DLG5）是膜相关鸟苷酸激酶（MAGUK）家族成员[2]。MAGUK蛋白包括催化失活鸟苷酸激酶结构域，PDZ结构域和SH3结构域[2,8]，所有这些结构域都与蛋白-蛋白间的相互作用相关，因此支持DLG5是一种多功能调节蛋白和支架蛋白。Tomiyama等研究发现DLG5可以与Vixin蛋白相结合，并且发现DLG5可以与β-连环蛋白在细胞膜共定位[9]。DLG5还可以与其他蛋白相结合，包括p55、KIF20A、syntaxin 4和柠檬酸激酶[2-4,6]。DLG5具有许多重要的生理作用，DLG5在调节细胞迁移和维持上皮细胞极性方面发挥了重要作用[6,10,11]。基因敲除小鼠模型发现DLG5是维持细胞极性和细胞间粘附连接的必需蛋白[6]。DLG5参与构成细胞的紧密连接，并且在哺乳动物大脑、肾脏[6]和肺[11]上皮细胞的极性维持中发挥了重要作用。近期研究发现DLG5可以通过减弱TGF-β[12-13]信号通路抑制肾上皮细胞和前列腺上皮细胞发生上皮间质转化（EMT）。在许多侵袭性强的恶性肿瘤中也检测到DLG5表达下调[9-10,14-15]。Tomiyama等研究发现慢病毒敲除DLG5可以使前列腺癌细胞的侵袭和转移能力明显增强[9]。Smolen等研究发现高组织学分级和预后较差的乳腺癌组织DLG5表达下调，并且敲除DLG5可以诱导乳腺上皮细胞迁移[10]。本研究通过运用免疫组化方法检测了210例I期和IIIA期肺腺癌组织中DLG5的表达情况，DLG5表达与淋巴结转移呈负相关。并且进一步运用Western blot方法检测发现肺腺癌组织中DLG5的阳性表达率明显低于癌旁组织。这些研究结果提示我们DLG5可能作为一种抑癌因子发挥作用。

目前国内外有关DLG5与肿瘤预后的相关研究较少，Ke等研究发现人肝细胞癌组织中DLG5的表达量明显低于癌旁非肿瘤组织，并且肝细胞癌细胞中DLG5的表达量也明显低于正常肝细胞。进一步研究发现DLG5低表达与肝细胞癌较晚分期，较短总生存期（OS）和DFS（diseasefree survival）相关，体内实验结果表明，DLG5过表达可以显著抑制肝细胞癌肝内转移和肺转移，DLG5可以作为HCC患者的预后预测因子[16]。Liu等[17]研究发现与乳腺癌组织相比，DLG5在正常乳腺组织中的表达量明显增加，DLG5在低级别乳腺癌组织中的表达量明显高于高级别肿瘤组织，在I期乳腺癌组织中的表达量高于II期，而II期高于III期。我们的研究结果显示IIIA期肺腺癌组织中DLG5的阳性表达率明显低于I期患者。DLG5表达阴性的患者，中位生存期明显短于表达阳性的患者（20.0个月vs 67.0个月），差异有统计学意义（χ2=8.522，P=0.004）。生存分析显示DLG5是肺腺癌的独立预后影响因素。这些研究表明DLG5可能作为肺癌预后的预测因子。

我们的研究发现肺腺癌组织中DLG5的阳性表达率明显低于癌旁肺组织，DLG5与肺腺癌淋巴结转移相关，DLG5是肺腺癌的独立预后影响因素。同时我们的结果也显示TNM分期也是影响非小细胞肺癌预后独立的因素，随着分期的推后，预后逐渐变差，因此合理精确的分期能够指导术后恰当的综合治疗。目前随着综合治疗手段的不断提升，包括靶向治疗、免疫治疗，另外随着整个人群健康意识的提高，生活方式的改变与调整，可能都会对非小细胞肺癌患者预后产生一定的影响。

许多研究进一步探讨了DLG5在肿瘤侵袭转移中的可能机制。Ke等运用基因敲除技术沉默正常人肝细胞HepG2 DLG5的表达后，促进了HepG2细胞发生EMT和伪足形成，并增强了伪足相关的侵袭能力[16]。Liu等研究发现DLG5表达缺失可以诱导乳腺癌细胞发生EMT，表现为ZO1表达减低而Vimentin表达增加。并且DLG5表达缺失可以扰乱上皮细胞极性，进而增强乳腺癌细胞的侵袭转移能力[17]。Tomiyame等研究发现DLG5可以与Girdin相互作用，抑制Girdin的活性，进而抑制前列腺癌细胞的迁移能力[9]。我们将进一步探讨DLG5对肺腺癌侵袭转移能力影响的可能机制。