Nrf2 / HO-1通路在电针减轻肢体缺血再灌注诱发兔肺损伤中的作用

王德强，余剑波，阚永星，宫丽荣

肢体缺血再灌注是血管严重创伤、骨科手术及栓塞性血管病常见的病理生理过程，再灌注诱发的氧化应激不仅引起肢体局部的进一步损伤，更可导致远隔脏器损伤，其中肺脏是最易受累的器官[1-2]。前期研究表明，电针刺可减轻肢体缺血再灌注诱发的肺损伤[3]，但具体作用机制不明确。核因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞内调节氧化应激的重要转录因子，其可调控血红素氧合酶-1（HO-1）的表达，从而发挥抗氧化作用[4-5]。研究表明，Nrf2/HO-1信号通路参与了肢体缺血再灌注诱发肺损伤的过程[6]。本文探讨Nrf2/HO-1信号通路在电针减轻肢体缺血再灌注诱发兔肺损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 本研究经中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委员会批准。健康清洁级新西兰大白兔40只，雄性，体质量2.0～2.5 kg，3月龄，中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。G6805-1A低频电子脉冲治疗仪（上海华谊医用仪器有限公司）；Nrf2抑制剂全反式维甲酸（Sigma公司，美国）；戊巴比妥纳（百奥莱博公司）；Nrf2、HO-1兔多克隆抗体（Abcam公司，美国）；β-actin一抗、DAB显色试盒（Santa Cruz公司，美国）；山羊抗兔IgG二抗（北京康为世纪生物科技有限公司）；SOD活性测定试剂盒及MDA含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 分组和模型制作 根据预实验，选取40只新西兰大白兔采用随机数字表法随机分为假手术组、模型组、电针组和全反式维甲酸组（n=10）。参照文献[7]的方法建立肢体缺血再灌注模型。戊巴比妥纳30 mg/kg腹腔注射麻醉后仰卧位固定于特制兔台，右颈内静脉穿刺置管以备输液。于兔双后肢股动脉三角区备皮、消毒并切开，分离出股静脉、股动脉后用微型动脉夹在近腹股沟韧带处夹闭股动脉3 h形成缺血期，松开无创微动脉夹后再灌注4 h形成再灌注期。假手术组只放置微型动脉夹而不夹闭股动脉。全反式维甲酸组于模型制备前30 min腹腔注射Nrf2抑制剂全反式维甲酸7 mg/kg。实验期间持续静脉输注生理盐水1.5 mL ·kg-1·h-1。

1.3 电针刺预处理 参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”，选取兔双侧足三里穴（后肢背外侧，胫骨粗隆下部外约0.3 cm处）和肺俞穴（背部第3胸椎棘突下旁开约1.5 cm处）。采用特殊兔盒暴露针刺部位，局部消毒后，采用直径0.3 mm一次性无菌针灸针直刺进针约4～6 mm接G6805-1A低频电子脉冲治疗仪进行刺激。针刺参数设置：频率2/15 Hz，刺激电流l～2 mA，疏密波，以兔出现轻微肌颤为宜，每次持续30 min，1次/d。电针组及全反式维甲酸组于模型制备前1～4 d及模型制备过程中给与电针刺激。

1.4 标本采集 再灌注4 h时采用颈总动脉放血法处死兔，留取双肺组织。取右肺上叶组织测定W/D比值，取部分左肺组织用10%多聚甲醛固定，取部分左肺组织经液氮速冻处理后冻存于-80 ℃冰箱。

1.5 肺组织W/D比值的测定 取右肺上叶部分组织，纱布拭去水渍，置于精细天平上称湿重（W），然后置于80 ℃电热恒温干燥箱烘干至恒重后称干重（D），计算肺组织W/D比值。

1.6 肺损伤评分 左肺上叶组织置于10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋连续切片（4 µm），HE染色，在光学显微镜下观察病理学结果。参照文献[8]的方法进行肺损伤评分，取其平均值作为总体的肺组织损伤评分。

1.7 肺组织SOD活性和MDA含量的测定取-80℃冻存肺组织制备10%组织匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，所有步骤严格按照试剂盒操作步骤进行测定。

1.8 Western blotting法检测肺组织Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白及HO-l蛋白表达 取-80 ℃冻存肺组织，按照蛋白提取试剂盒说明书提取组织总蛋白及核蛋白，10 000 g离心15 min后取上清液按照BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取样品10 µg蛋白经凝胶恒压电泳、转膜、封闭1 h后加入一抗（1∶1000）4 ℃孵育过夜。TBST清洗后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶3000）室温孵育1 h后漂洗。TBST漂洗后于暗室中进行显色和曝光，采用Quantity One图像分析软件进行分析，以目的蛋白与内参β-actin条带积分光密度值的比值反映Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白及HO-l蛋白表达水平。1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，所有数据以均数±标准差（ ）表示，采用双侧检验，通过Ryan-Joiner法行正态性检验，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。选取P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学变化 检测结果显示（见图1、表1），灌注4 h时，假手术组兔肺组织未见明显病理改变，模型组、电针组及全反式维甲酸组可见不同程度肺泡或间质水肿、炎细胞浸润、可见出血，电针组水肿、炎细胞浸润和出血均较模型组减轻。模型组、电针组及全反式维甲酸组的肺损伤评分明显高于假手术组（P＜0.05），电针组的肺损伤评分明显低于模型（P＜0.05），全反式维甲酸组的肺损伤评分明显高于电针组（P＜0.05）。

图1 各组兔肺组织理表现 （HE×100）

2.2 肺组织W/D比值的变化 测定结果显示（见表1），灌注4 h时，模型组、电针组及全反式维甲酸组的W/D比值明显高于假手术组（P＜0.05），电针组的W/D比值明显低于模型 （P＜0.05），全反式维甲酸组的W/D比值明显高于电针组（P＜0.05）。

2.3 肺组织SOD活性和MDA含量变化 结果显示，灌注4 h时，与假手术组比较，模型组、电针组及全反式维甲酸组的MDA含量明显升高、SOD活性明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，电针组MDA含量明显降低、SOD活性明显升高（P＜0.05）；与电针组比较，全反式维甲酸组明显升高、SOD活性明显降低（P＜0.05）。见表1.

表1 各组兔肺损伤评分、W/D比值、MDA含量及SOD活性的比较

2.4 肺组织Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白变化Western blotting结果显示，灌注4 h时，模型组、电针组及全反式维甲酸组的Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白表达明显高于假手术组 （P＜0.05），电针组的Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白表达明显高于模型组（P＜0.05），全反式维甲酸组的Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白表达明显低于电针组，（P＜0.05）。见图2。

图2 各组肺组织Nrf2核蛋白、Nrf2总蛋白表达的变化

2.5 肺组织HO-l蛋白变化 Western blotting结果显示，灌注4 h时，模型组、电针组及全反式维甲酸组的HO-l蛋白表达明显高于假手术组（P＜0.05），电针组的HO-l蛋白表达明显高于模型组（P＜0.05），全反式维甲酸组的HO-l蛋白表达明显低于电针组，（P＜0.05）。见图3。

3 讨论

图3 各组HO-l蛋白表达的变化

肢体缺血再灌注引起远隔肺损伤发病机制复杂, 其中再灌注引起的氧自由基和活性氧大量产生所导致的氧化应激损伤已被认为是肢体缺血再灌注诱发肺损伤的重要机制[1,9]。肺脏是富含脂质的器官，很容易受到积蓄氧自由基的攻击造成脂质过氧化，从而引起细胞损伤。MDA为脂质、蛋白质过氧化过程中的产物，其高低可反映氧自由基对细胞膜结构的损伤程度。SOD是体内重要的抗氧化蛋白酶，可去除机体生物氧化产生的氧自由基，MDA和SOD均可特异性反映氧化应激损伤程度[10-11]。本研究显示，兔肢体缺血3 h 再灌注4 h后，肺组织W/D、肺损伤评分及MDA含量升高，而SOD活性降低。证实了氧化应激反应参与肢体缺血再灌注诱发肺损伤的过程。

Nrf2是Ⅱ相解毒酶的关键性转录因子。生理状态下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap-l）结合定位于细胞质，其活性处于相对抑制状态；在氧化应激状态下，活性氧或亲电子化合物的积聚使Nrf2从胞浆蛋白Keap-1中解离，易位至细胞核与抗氧化反应元件结合，诱导SOD、HO-l、过氧化氢酶等抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达，而对抗氧化应激反应[4,12]。HO-l是催化血红素降解为一氧化碳、胆红素和游离铁的关键酶和限速酶，在几乎所有哺乳动物中均可表达，被认为是一种内源性保护的早期应激酶，在多种刺激因素引起的氧化应激状态下表达增加，通过抗氧化损伤、抗炎性反应或抗细胞凋亡等多重机制在多种生理病理过程中发挥重要调节作用[13-14]。研究表明，肢体缺血再灌注诱发肺损伤的过程中，Nrf2/HO-1信号通路被激活，减轻肺损伤的发生[6]。

电针刺激具有双向调节作用，可通过减少氧自由基产生、抗氧化应激对脏器起保护作用[15-16]。足三里属于足阳明胃经穴，肺俞穴属于足太阳膀胱经穴。研究表明，电针刺足三里和肺俞穴位能够减轻脂多糖诱导的肺损伤，其机制可能与其抗氧化应激、抗炎症反应的作用有关[17]。本研究于肢体缺血再灌注模型制备前进行电针刺预处理并参照文献[18]方法给予Nrf2抑制剂全反式维甲酸7 mg/kg。结果表明，电针刺足三里和肺俞穴可上调兔肺组织Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白及HO-l蛋白的表达，并降低MDA含量、增强SOD活性，减轻兔肺损伤；而Nrf2抑制剂全反式维甲酸可部分拮抗电针刺的这种肺保护作用。综合研究结果，可能提示Nrf2/HO-1信号通路的激活，从而增强机体抗氧化损伤能力参与了电针减轻肢体缺血再灌注诱发兔肺损伤的过程，其它可能涉及的机制及调节Nrf2/HO-1信号通路的上游机制待研究。