奶牛乳腺上皮细胞的培养及NOD2定位

徐丹丹 王 刚

黑龙江省五大连池市农业农村局，黑龙江五大连池 164100

NOD2是近年来才被发现的哺乳动物固有免疫受体之一的NLRs（NOD-like receptors）家族中重要的一员，它通过识别细菌的细胞壁成分——胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP），从而激活下游的炎症信号通路，帮助机体抵抗外来病原的侵袭。NOD2受体参与机体抵抗葡萄球菌、志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、嗜肺军团菌、李斯特菌等多种细菌感染。更有研究表明，NOD2还参与抵抗肺炎衣原体、呼吸道合胞体病毒及弓形虫侵袭。奶牛乳腺中有NOD2的表达，但NOD2受体在奶牛乳腺上皮细胞中的具体位置仍没有明确的报道。因此，本试验采用胶原酶Ⅰ消化法体外培养奶牛乳腺上皮细胞，分离纯化并鉴定该细胞；采用免疫荧光技术对乳腺上皮细胞中的NOD2受体进行定位，为今后研究NOD2受体在奶牛乳腺中的作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 组织来源

奶牛乳腺组织取自黑龙江省大庆市某屠宰场1头因外伤淘汰的处于泌乳期的荷斯坦奶牛。

1.2 主要试剂

DMEM F/12培养基（GIBCO公司），胎牛血清（FBS）（Hyclone公司），胶原酶Ⅰ（Invivogen公司），胰蛋白酶（碧云天公司），NOD2抗体（Proteintech公司）。

1.3 奶牛乳腺上皮细胞的体外培养

1）奶牛乳腺细胞的培养。取新鲜宰杀动物体内乳腺组织为试验材料，使用胶原酶I消化法制备奶牛乳腺上皮细胞。细胞贴壁后，每2 d换液1次。

2）奶牛乳腺上皮细胞的分离纯化。根据成纤维细胞与上皮细胞对胰酶的耐受能力不同以及贴壁时间的差异分离纯化奶牛乳腺上皮细胞。

1.4 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定及NOD2定位

将纯化后的奶牛乳腺上皮细胞用NOD2抗体4℃孵育，加入对应二抗与之结合，37℃作用1 h，PBS漂洗，加入细胞鉴定孔作用5～10 min后使用抗猝灭剂封片，荧光显微镜下观察结果。

2 结果与分析

2.1 奶牛乳腺细胞的培养与分离纯化

奶牛乳腺细胞培养第3天时可看到生长状态良好且分界明显的乳腺上皮细胞与成纤维细胞，培养至第5天时细胞长满至瓶底80%～90%。对细胞分离纯化2～3次后，可见较为纯净的典型“铺路石”或“鹅卵石”样奶牛乳腺上皮细胞，细胞核及核仁（多为多核仁）清晰可见，且部分细胞已经具有乳汁分泌功能（图1）。

图1 纯化后的奶牛乳腺上皮细胞（100×）

2.2 奶牛乳腺上皮细胞中NOD2的定位

免疫荧光对乳腺上皮细胞NOD2定位结果显示，NOD2多位于细胞核，尤其以核仁表达量最高，且具有乳汁分泌功能的乳腺上皮细胞核仁中NOD2的表达量要高于非泌乳乳腺上皮细胞（图2a、图 2b）。

图2 奶牛乳腺上皮细胞中NOD2的定位结果（200×）

3 讨论

乳腺上皮细胞的培养历史至今已有近60年。相关文献表明，酶消化法易破坏奶牛乳腺组织和细胞结构，不宜培养成功或即使培养成功传代次数也较少，这可能由于操作时没有控制好酶浓度或消化时间。这就要求我们采用酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞时，根据组织来源、组织状态以及酶的质量合理控制消化时间，保证奶牛乳腺上皮细胞能够正常贴壁生长。奶牛乳腺上皮细胞的培养结果显示，采用胶原酶Ⅰ消化法，经分离纯化后成功获得了较为纯净的奶牛乳腺上皮细胞[1]，且生长状态良好，可以用于后续试验。

Whelehan等[2]研究，NOD2存在于奶牛乳腺腺泡、乳导管、乳池及乳头组织。近年来的相关研究证实，NOD2基因的突变与克罗恩病及Blau综合征等疾病密切相关，目前NOD2在奶牛乳腺中的作用研究的仍较少。本试验首次对奶牛乳腺上皮细胞中NOD2受体进行定位，结果显示，奶牛乳腺上皮细胞中NOD2受体多存在于细胞核且主要集中在核仁中，同时发现具有泌乳功能的乳腺上皮细胞中NOD2的表达量明显高于非泌乳乳腺上皮细胞，这可能是奶牛在泌乳期提高乳腺免疫防御机能的一种体现，但这种机能的体现受何种因素调控以及存在于核仁的NOD2受体是否参与rRNA合成和核糖体组装还有待于进一步研究。

总之，本试验采用胶原酶Ⅰ消化法成功获得了生长状态良好的奶牛乳腺上皮细胞，且对奶牛乳腺上皮细胞进行免疫荧光定位，这些结果为研究NOD2在奶牛乳腺上皮细胞中的作用提供了很好的理论基础和试验依据。