四川省石渠县高原鼠兔棘球蚴感染情况调查

杜雪梅,钟 维,唐天才,郝力力

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川 成都 610041)

石渠县隶属四川省甘孜藏族自治州,是棘球蚴病的重度流行地区,其中泡型棘球蚴和细粒棘球蚴均有流行。高原鼠兔,属兔形目、鼠兔属,是多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫的重要中间宿主。据2017年调查显示,石渠县高原鼠兔平均密度达到9.58只/亩,相当于全县约有3.6亿只[1],是当地数量最多的物种。高原鼠兔中间宿主因吞食虫卵受感染,虫卵在体内发育成幼虫,被狐狸、流浪犬、家犬等终末宿主捕食,终末宿主将虫卵和孕节随粪便排出体外,污染土壤和草地,中间宿主经口摄入虫卵而感染棘球蚴病。多房棘球绦虫可感染人,而石渠棘球绦虫尚未发现感染人的病例。石渠县包虫病综合防治工作自2015年正式启动以来,国家投入了大量资金,形成了以“双灭源”、“三切断”、“八举措”为主的“238”高寒藏区畜间包虫病防控新模式。截至2017年总共完成家犬驱虫282,301只/次,每月驱虫完成率达99.99%;共登记、拴养家犬18 368只,登记拴养率达100%,犬只管理实现了规范化[2]。调查高原鼠兔是了解当地棘球蚴病流行的重要指标,也是重要的中间宿主。本试验用PCR方法扩增石渠棘球绦虫和多房棘球绦虫的ND1基因,对石渠县高原鼠兔棘球蚴的感染情况进行调查,以期为当地棘球蚴病的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备和试剂 台式高速离心机(Eppendorf 5402型)、Bio-Rad伯乐梯度PCR仪(PTC240型)、2×EasyTaq PCR Super Mix(北京全式金生物技术有限公司);组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2 组织样本 采集时间为2017年5月20日到5月23日,由省动物疫控中心负责采集,共采集82份高原鼠兔肝肺组织,所有样本均来自四川省石渠县色须镇。多房棘球绦虫基因组DNA,由本实验组保存。

1.3 DNA模板制备 使用天根生化科技(北京)有限公司组织基因DNA提取试剂盒,按照说明书进行操作。

1.4 引物设计 本试验中采用PCR方法行进检测。反应中所用引物采用Sean等[3]设计ND1基因检测石渠棘球绦虫,序列如下,EsF50：5′-TTATTCTCAGTCTCGTAAGGGTCCG-3′,EsR73： 5′-CAATAACCAACTACATCAATAATT-3′,最终产物大小在400 bp～500 bp之间。(此引物是可以检出细粒、多房和石渠棘球绦虫的基因序列)。

1.5 ND1基因序列的PCR扩增、同源性分析及进化树构建 PCR反应采用25 μL体系：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5μL、上下游引物各 1 μL(10 μmol/L)、DNA 模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。 PCR 反应条件：94 ℃预变性4 min;然后40个循环：94℃ 20 s,55℃ 35 s,72℃ 30 s;最后72℃延伸8 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中,以0.5xTBE缓冲液,100 V电压电泳30 min。电泳结束后,在紫外灯下观察目的基因条带,记录阳性鉴定结果并拍照保存。挑选PCR阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。运用Lasergene 7.0软件对所测得的序列拼接、比对和同源性分析,用MEGA 6构建分子进化树。

2 结果与分析

2.1 剖解疑似感染石渠棘球蚴的高原鼠兔 棘球绦虫幼虫在高原鼠兔的肝肺脏器内可发育成为直径约10 mm的微小包囊(见中插彩版图1)。与细粒棘球绦虫的包囊不同,以单个包囊存在。囊表面光滑、呈白色、囊液清澈。包囊内有育囊,未发现子囊。囊的角质层较厚,而由宿主形成的外围纤维层却很薄。

2.2 石渠县高原鼠兔棘球蚴ND1基因的PCR检测及其感染率 82份高原鼠兔肝肺组织样本经PCR检测,共检出5份阳性,感染率为6.10%(5/82),感染的虫种均为石渠棘球绦虫,未检测到多房棘球绦虫。其片段大小约为442 bp,见图2。

图2 部分高原鼠兔组织样本PCR反应后电泳图

2.3 序列比对、进化树构建及分析 应用Lasergene 7.0软件对扩增出的ND1基因序列与报道的石渠棘球绦虫的ND1基因序列进行同源性分析(图3)。由图3可见,来自石渠县高原鼠兔感染的棘球蚴与石渠县报道的石渠棘球绦虫(E.shiqu AB208064)同源性在99.0% ～99.7%之间(图3中对应序号分别为1、2、3、4、5),其中 2和 3 序列之间同源性为100%。而分离株序列与细粒棘球绦虫(E.g KY766908)同源性在52.6% ～53.0%之间;与多房棘球绦虫(E.m KF171965)同源性在84.5%～85.5%之间。

图3 石渠棘球绦虫ND1基因同源性比较

应用Mega 6软件绘制系统发育进化树(图4)。从建立的进化树图4可以看出,高原鼠兔感染的棘球蚴(图 4中对应序号 E.shiqu1、E.shiqu2、E.shiqu4、E.shiqu5)与石渠县报道的石渠棘球绦虫(E.shiqu AB208064)位于同一分支上,进化关系较近;4个分离株与细粒棘球绦虫(E.g KY766908)在一个分支上但进化关系较远,与多房棘球绦虫(E.m KF171965)不在同一个分支上。

图4 基于石渠棘球绦虫ND1基因的进化树分析

3 讨论

石渠县位于四川省的最西北部,有“四川省第一畜牧业大县”之称,是细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫的流行区。中间宿主感染棘球蚴,已经成为全球性重要的公共卫生问题和社会经济问题[4],其中细粒棘球蚴可感染人和家畜,多房棘球蚴感染人和啮齿类动物,而石渠棘球蚴尚未在人和家畜上发现病例,仅感染啮齿类动物。啮齿类中间宿主的存在对棘球绦虫生活史循环链的形成和棘球绦虫种群的维持、延续具有重要意义[5]。2012年张高天等发现,在四川省西部2000、1990-2005、2012年期间高原鼠兔棘球蚴感染率分别为5.60%、5.27%、5.70%[6]。2013年黄富强等发现,青海省称多县的高原鼠兔棘球蚴感染率为4.14%(6/145),而藏羊和牦牛棘球蚴的感染率分别为52.30%、36.77%,高原鼠兔的感染率远低于家畜的感染率[7]。2016年杨世杰等调查四川省石渠县啮齿类棘球蚴感染率为4.93%(200/4 054)[8]。本试验调查数据显示,该地区高原鼠兔棘球蚴的感染率为6.10%。可见近年来石渠县自然状况下高原鼠兔棘球蚴的感染率数据并不高,但是高原鼠兔在石渠县上分布广泛,种群数量极大,是狐狸和流浪犬的捕食对象,形成了多房和石渠棘球绦虫在犬和狐狸与中间宿主高原鼠兔间的循环感染,导致了传染源的持续存在,使得棘球绦虫在石渠县的流行状况复杂。

本试验高原鼠兔棘球蚴感染的均是石渠棘球蚴,未检测到多房棘球蚴的感染,可能的原因有：试验采集的82份高原鼠兔样本是有明显包囊病变的肝肺组织,没有收集表面正常的样本,而多房棘球蚴感染高原鼠兔为囊泡状,且早期感染阶段症状不明显,因此未检测到多房棘球蚴的感染。综上所述,本试验对四川省石渠县高原鼠兔棘球蚴的感染情况进行了调查。后期需要进一步增加调查地点和表面正常的肝肺组织样本的收集,以及扩大调查范围、中间宿主的种类(如：高原鼢鼠)、样本数量,并对终末宿主犬感染棘球蚴的情况进行充分调查。