患子宫内膜炎母猪阴道菌群变化与发病关系研究

黄安妮,闫 鹤

(华南理工大学食品科学与工程学院,广东 广州 510641)

母猪子宫内膜炎症是目前规模化猪场较为常见生殖道疾病之一[1],该病发病率高,50%以上的母猪繁殖性疾病是由子宫内膜炎引起的[2]。该病一般是由于病原菌进入母猪子宫内,黏附在子宫黏膜破损处,引起母猪子宫黏膜表层或深层发生黏液化或者化脓性炎症[3],患病母猪会在阴道或外阴处发现有粘性或脓性分泌物[4]。患子宫内膜炎症会严重影响母畜发情周期,导致屡配不孕,即使偶尔配上也会产弱猪、死胎、木乃伊胎或假孕,造成巨大的经济损失,严重影响猪群的健康[1]。

准确掌握母猪生殖道内的菌群结构情况对更好地、有针对性的治疗母猪子宫内膜炎至关重要[5]。阴道是一个开放性腔道,是重要的微生态区系,有众多的微生物栖居于此,正常阴道腔内的微生物与宿主、环境保持着协调的、动态的平衡[6]。相关研究表明,阴道微环境平衡对维持其自净及宿主健康起着重要作用[7],是宿主抵御致病菌或条件致病茵的一道重要的生物学屏障[8]。

到目前为止,猪的阴道微生物群通常只通过细菌培养确定,然而,自然环境中只有不到1%的微生物能用常规培养方法检测到[9],同时由于母猪阴道菌群多为厌氧菌或兼性厌氧菌[10],营养要求苛刻,因此使用传统培养方法难以全面地认识阴道菌群分布[11]。随着高通量测序技术的出现,使得微生物组学的研究更加全面和准确。本文利用Illumina MiSeq高通量测序平台对健康产仔后母猪和患子宫内膜炎母猪的阴道菌群进行分析,以探究患子宫内膜炎母猪阴道可能存在的病原。

1 材料与方法

1.1 样本采集 2017年9月广东省某规模化猪场多头母猪出现产仔后准备再次受孕时阴道流脓现象,随机取其中3头母猪的阴道黏液,用无菌阴道棉拭子于阴道取分泌物,避免接触到阴道口和外阴部以防污染,取出后立即放入2.0 mL无菌离心管中,将离心管放入干冰中,带回实验室保存在-80℃冰箱,提取总基因时取出。用同样的阴道拭子采集方法收集同一猪场产后体况良好、无子宫内膜炎和繁殖病史的母猪阴道样本10份。

1.2 DNA抽提和PCR扩增 利用QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN,Germany)提取微生物总DNA,DNA浓度和纯度利用NanoDrop 2 000进行检测,DNA质量利用1%琼脂糖凝胶电泳检测;用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对 V3 ～V4可变区进行PCR扩增,扩增程序为：95℃预变性3 min;然后95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共27个循环;最后72℃延伸10 min(PCR仪：ABI GeneAmp®9 700型)。 扩增体系为 20 μL,4 μL 5∗FastPfu 缓冲液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL 引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu 聚合酶;10 ng DNA模板。

1.3 Illumina Miseq测序 使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction试剂盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)进行纯化,Tris-HCl洗脱,2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台(Illumina,San Diego,USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。利用 Illumina公司的 MiseqPE300平台进行测序。

1.4 数据处理与分析 原始测序序列使用Trimmomatic软件质控,用FLASH软件进行拼接：去除质控后长度低于50 bp的序列;引物允许2个碱基的错配,去除模糊碱基;根据重叠碱基Overlap将两端序列进行拼接,Overlap需大于10 bp,去除无法拼接的序列。利用UCHIME软件剔除嵌合体,采用RDP classifier(置信度阈值为0.7)对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析。选择Silva作为参考基因组数据库。使用Mothur软件计算样本Alpha多样性指数。基于Bray-Curtis算法计算样本间距离,并根据该距离对样本进行主坐标分析(PCoA)。利用Wilcoxon rank-sum test检验方法检测两组母猪阴道微生物群落物种差异显著性。

2 结果

2.1 产仔后健康母猪与患子宫内膜炎母猪阴道菌群多样性比较 13份阴道拭子样本经测序后共得到628 807条有效序列数,序列平均长度为413.12 bp,群落覆盖度超过99.19%,表明所有样本的测序深度足够,可以反映样本的微生物信息。两组样本Alpha多样性分析如表1所示,Sobs,Ace和Chao指数用来估算样品中微生物丰富度,与健康组相比,患子宫内膜炎组阴道菌群丰富度水平升高,且两组间有显著性差异(P＜0.001)。同时,表中Shannon指数对比说明患病组母猪阴道菌群的多样性高于健康组。基于Bray-Curtis距离的PCoA分析(Principal co-ordinates analysis)比较两组的群落结构差异。主坐标成分(PC1,PC2和PC3)占有70.59%的样本组成差异,表明健康母猪与患子宫内膜炎母猪的阴道菌群组成是可以相互区分的,而组间个体微生物菌群组成相似(见封三彩版图1)。

表1 两组样本Alpha多样性分析

2.2 菌群群落结构门水平组成分析 在门水平,健康组共鉴定出5个相对丰度大于1%的优势菌门,患病组鉴定出8个优势菌门,见封三彩版图2A。健康组中厚壁菌门(Firmicutes)占总数的55.14%,其次拟杆菌门(Bacteroidetes)占15.89%,变形菌门(Proteobacteria)占14.40%,放线菌门(Actinobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)分别为9.90%和3.59%,优势菌门丰度总计可达到98.92%。患子宫内膜炎组的优势菌门有：变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和未分类菌门(Unclassified_k_norank),平均相对丰度分别为73.49%、7.89%、5.24%、4.34%、1.94%、1.86%、1.65%和1.44%,合计占总细菌量的97.84%。其中患子宫内膜炎母猪阴道菌群中的变形菌门显著高于健康母猪阴道样本(P＜0.05),而厚壁菌门和梭杆菌门的相对丰度显著低于健康样本(P＜0.05)(见封三彩版图3A)。

2.3 菌群群落结构属水平组成分析 在属水平总共检测到了794种菌属,其中健康组共有546种,患病组有571种。相对丰度大于1%的优势菌属在健康组与患病组中各有23种和10种,其中仅有葡萄菌属为共同优势菌属,在健康组占比为3.23%,低于疾病组的3.85%(见封三彩版图2B)。健康组的链球菌属是其阴道菌群内含量最高的菌属,占总数的 7.04%,梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)、拟杆菌属(Bacteroides)、放线杆菌(Actinobacillus)和幽门螺旋菌(Terrisporobacter)也在健康组高表达,且相对丰度均显著高于患子宫内膜炎样本(P＜0.05)见封三彩版图3B。患病组中Burkholderia-Paraburkholderia的相对丰度最高,达41.65%,显著高于健康组。除Burkholderia-Paraburkholderia外,仅有沙雷菌属(Serratia)、肠杆菌科-未分类(unclassified_f__Enterobacteriaceae)和葡萄球菌属等少数菌属在患病组中的丰度显著高于健康组(P＜0.05)(见封三彩版图3B)。

3 讨论

本试验利用Illumina高通量测序技术分析患子宫内膜炎母猪阴道菌群结构特征,发现疾病发生伴随着阴道微生物菌落组成结构的显著变化。研究结果发现,患病组母猪阴道菌群多样性与丰富度指数均高于健康组,表明患子宫内膜炎母猪阴道菌群结构更为复杂。类似的,许苏容等[11]运用高通量测序对育龄期女性阴道菌群多样性进行分析,发现健康育龄期女性菌群多样性显著高于细菌性阴道病患者。

本研究揭示出健康母猪阴道菌群在门水平上主要富集厚壁菌门,拟杆菌门,变形菌门,放线菌门和梭杆菌门,这5个菌门是Lorenzen等的研究中健康Göttingen迷你猪阴道菌群的优势菌门[10],结果也与Jun Wang等对健康母猪阴道菌群的研究相似[4]。患子宫内膜炎后的母猪,变形菌门占比显著增加,而该门包含有大量致病菌,例如Escherichia,Shigella,Burkholderia[12]。除变形菌门外,其余4个健康组的优势菌门在患病后相对丰度均相应降低,这与Jun Wang等[4]的研究结果存在一定差异,Jun Wang等在对4头健康母猪与4头患子宫内膜炎母猪阴道菌群测定时发现：厚壁菌门在健康组中相对丰度显著高于疾病组,变形菌门在患病组样品中上升为优势菌门,拟杆菌门和梭菌门在患病组的相对丰度均要高于健康组。不同实验室测定结果的不一致,可能与猪品种即遗传背景、饲养环境及饲料的营养标准不同有关。

一般认为,引起母猪子宫内膜炎的致病菌为葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia Coli)等[13-15]。Jun Wang等[4]分析患子宫内膜炎母猪阴道菌群,也发现在患病组中埃希氏-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、葡萄球菌属等含量均高于健康组。然而本研究结果显示,链球菌属、大肠志贺氏菌属在健康组中占比更高,葡萄球菌属在两组间含量相近,因此,我们认为该批次母猪子宫内膜炎症不是由上述3种致病菌引起的。进一步研究发现,Burkholderia-Paraburkholderia在疾病组的平均相对丰度高达41.65%,在健康组中检出率为0,是患病组中检测到的特有菌属,可能是导致该批次母猪患子宫内膜炎的主要原因。伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)包含大量菌种,包括许多与临床、植物相关的病原菌,以及与环境相关菌种[16]。伯克霍尔德氏菌近年被一些研究进一步细分为Burkholderia,Paraburkholderia两种菌属,与临床、植物相关的病原菌可归为Burkholderia,与环境相关菌可归为Paraburkholderia[16]。本研究未细分到菌种,因此用Burkholderia-Paraburkholderia概述。伯克霍尔德氏菌中部分菌种可引起感染病和炎症等[17-18],在人阴道菌群的报道中就发现,fungorum伯克霍尔德氏菌(Burkholderia fungorum)可能是和人的细菌性阴道炎相关的细菌[19-20]。这是首次发现Burkholderia-Paraburkholderia可能是引起母猪的子宫内膜炎的主要因素。

综上所述,本研究通过高通量测序技术发现了患子宫内膜炎母猪与健康母猪阴道菌群的差异,其中Burkholderia-Paraburkholderia丰度的增加可能与母猪的子宫内膜炎症密切相关。研究为患子宫内膜炎症母猪的预防及治疗提供依据。