尼古丁对大鼠主动脉平滑肌细胞舒缩功能的影响*

刘继斌， 秦小江， 岳 晗， 伊淑贤， 侯晓敏

(山西医科大学 1教务处， 2公共卫生学院， 3基础医学院， 山西 太原 030001)

吸烟是加速心脑血管疾病发生的重要危险因素之一。流行病学和实验研究表明，吸烟可增加机体炎症水平，导致高血压、脑血栓和动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生[1-3]。尼古丁(nicotine)作为香烟烟雾的主要毒性成分之一，已被证实可调控多种细胞功能的改变，如诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)发生迁移，通过影响VSMCs细胞膜上离子通道的活性和状态从而改变血管的紧张性。本研究基于鬼笔环肽染色法和胶原收缩法观察尼古丁对大鼠主动脉VSMCs舒缩功能的影响，为深入探讨尼古丁对血管功能异常引起的心血管疾病的病理机制提供基础依据。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SD大鼠，雄性，体重210～230 g，购自山西医科大学实验动物中心。动物许可证号为SCXK(晋) 2017-0001。

2 主要实验试剂

尼古丁(Sigma)；鼠尾胶原蛋白I型(杭州生友公司)；罗丹明-鬼笔环肽(广州威佳公司)；胎牛血清(Gibco)；L-谷氨酰胺(山东西亚化学工业有限公司)。

3 方法

3.1 大鼠主动脉VSMCs的培养及鉴定 首先使用乌拉坦对大鼠进行腹腔注射麻醉，参照文献[4-6]，用袖套式剥离法去除血管外膜，然后用眼科弯镊钝性刮除内膜，最终获得血管平滑肌细胞层。向培养皿中加入少许含胎牛血清(20%)的培养液，用眼科小剪刀将血管中膜层剪碎成为(1～2) mm×1 mm左右的小组织块，并将其均匀平铺于培养瓶底部。轻轻翻转培养瓶，瓶底朝上并向瓶内注入培养基，培养箱中静置2 h后，缓慢将培养瓶翻转放平。每3～5天换液1次，当组织块周围细胞爬出并大部分组织周围细胞融合至80%以上，进行首次传代，选取第4～6代的细胞进行后续实验。利用免疫组织化学方法，使用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)单克隆抗体对细胞进行鉴定。

3.2 鬼笔环肽染色法观察不同浓度的尼古丁对大鼠VSMCs收缩功能的影响 将VSMCs用胰蛋白酶消化后，接种于6孔板中，置于孵箱中培养(37 ℃、5% CO2)，当融合度为50%时，换含0.5%胎牛血清的培养基继续培养24 h，然后将VSMCs分为4个实验组和1个对照(control)组进行培养,实验组分别加入浓度为0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的尼古丁，对照组加入等量的含0.5%胎牛血清的培养基[6]，继续培养24 h。

用PBS清洗VSMCs 2次，每次5 min。然后室温下用4%多聚甲醛固定VSMCs 10 min，PBS清洗VSMCs 3次,每次5 min。5 μL TRITC-鬼笔环肽贮存液加入150 μL PBS中，配成工作液用于细胞染色。将6孔板转至暗室中，室温染色，使用DAPI复染，PBS冲洗3次，每次10 min。吸去多余水分，封片，共聚焦显微镜下分别拍摄不同实验组的照片，再用ImageJ软件计算细胞的表面积(μm2)。

3.3 胶原收缩法观察不同浓度的尼古丁对大鼠VSMCs收缩功能影响 依据上述鬼笔环肽染色法发现，尼古丁对大鼠主动脉VSMCs的最适刺激浓度为10 μmol/L，因此我们选择10 μmol/L尼古丁继续使用胶原收缩法对VSMCs收缩情况进行动态观察。

向制备好的三维胶原中加入100 μL 10×PBS或10×培养液，混匀后立即加到培养皿中。将10 μmol/L尼古丁处理的大鼠主动脉VSMCs种植于胶原凝胶中，将培养皿在室温下放置20 min，待胶凝固后，转移到培养箱内。然后我们分别观察加入尼古丁后0 min、10 min、20 min、40 min和60 min时的胶原收缩情况，对各个时点的胶原面积进行拍照，用ImageJ软件测量胶原面积。胶原收缩相对百分比(%)=收缩后胶原面积/收缩前胶原面积×100%。

4 统计学处理

所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示，统计学分析使用两因素重复测量方差分析，利用GraphPad Prism 7进行统计分析并作图，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定

原代培养第4～6天，可见少量细胞自组织块边缘游出，见图 1A，且形态多样，梭形居多。原代培养VSMCs的胞体较小，胞质折光性强，10 d左右细胞显著增多，高低起伏呈“峰、谷”状生长，见图1B。

选择第3～5代稳定生长的VSMCs作为观察对象，经特异性的α-SMA免疫组化染色后，高倍镜下能看到与细胞长轴平行的细胞蛋白肌丝呈阳性反应，见图1C。

2 鬼笔环肽法检测尼古丁对大鼠主动脉VSMCs收缩能力的影响

分别取0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的尼古丁作用于VSMCs，24 h后固定细胞，固定细胞后用罗丹明-鬼笔环肽染细胞骨架[7]，计算细胞表面积。结果显示，0.1 μmol/L的尼古丁作用后无明显变化；1 μmol/L的尼古丁作用后VSMCs的肌丝数量显著增多，细胞板状化明显；10 μmol/L的尼古丁作用后，VSMCs呈现出较高的张力状态，而100 μmol/L尼古丁导致细胞活力显著降低。分别对不同组的VSMCs拍摄照片，再用ImageJ软件计算细胞的表面积(μm2)，见图2。

Figure 1. The primary culture and identification of rat aortic VSMCs. A: rat aorta tissue block; B: primarily cultured rat aortic VSMCs (×10); C: identification of VSMCs by immunocytochemical staining of α-smooth muscle actin (×100).

图1 大鼠主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定

Figure 2. The effect of nicotine on the contraction of rat aortic VSMCs was detected by skeleton staining(×100). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图2 利用细胞骨架染色法检测尼古丁对大鼠主动脉血管平滑肌细胞收缩功能的影响

3 胶原收缩法检测尼古丁对大鼠主动脉VSMCs收缩能力的影响

鉴于前述鬼笔环肽染色法实验结果提示，10 μmol/L是尼古丁对大鼠主动脉VSMCs的最适处理浓度，因此在胶原收缩法进行动态观察时，我们只对尼古丁选取10 μmol/L浓度进行实验。实验结果提示，将10μmol/L尼古丁处理的VSMCs种植于胶原中，分别在不同时点(0 min、10 min、20 min、40 min和60 min)进行观察。随着时间的增加，胶原收缩逐渐明显，在60 min时达到最大收缩幅度(P<0.01)。该实验结果表明尼古丁对大鼠血管主动脉VSMCs的收缩作用除了具有浓度依赖性，还具有时间依赖性，见图3。

Figure 3. The effect of nicotine on the contraction of rat aortic VSMCs was detected by collagen contraction method. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 min group.

图3 利用胶原收缩法检测尼古丁对大鼠主动脉血管平滑肌细胞收缩功能的影响

讨 论

尼古丁是烟草的主要成分之一，已有研究证实其可以调控多种细胞功能的变化[8]、加重脑卒中所致脑损伤等[3, 9]。VSMCs位于动脉血管壁的中层，是构成血管壁的重要细胞[10]，对维持机体正常功能非常重要，多种刺激因子由于损伤VSMCs而造成相关的一些心血管疾病，如尼古丁能够增加活性氧簇和降低一氧化氮的活力等[1]。本实验对培养的VSMCs经不同浓度的尼古丁处理后发现，通过2种不同的实验方法(鬼笔环肽法和胶原收缩法)观察了大鼠血管平滑肌细胞的舒张收缩功能的变化。

本研究中利用鬼笔环肽法对VSMCs骨架进行检测，实验结果显示，将大鼠主动脉VSMCs用罗丹明-鬼笔环肽染色后，随着尼古丁浓度的增加，VSMCs板状化明显，肌丝数量显著增多，呈现出明显的收缩状态。这种实验方法虽然可以观察到尼古丁对细胞骨架的影响，但是不能对细胞进行连续性的动态观察，因此我们接下来又使用了胶原收缩法继续对尼古丁对VSMCs的收缩作用进行了连贯性的观察。

胶原收缩法是一种间接反映细胞收缩能力的实验方法，与鬼笔环肽染色法类似，使用胶原收缩法同样验证了尼古丁对大鼠主动脉VSMCs收缩能力的影响。使用10 μmol/L的尼古丁对细胞进行干预后，种植于凝胶中，开始作用时，尼古丁并没有对胶原面积产生明显影响，作用20 min时可见胶原呈现显著收缩，随着时间的延长，当作用60 min时胶原收缩最为显著。该实验结果提示，尼古丁对大鼠主动脉VSMCs的收缩作用不仅与其浓度有关系，还具有时间依赖性。

本研究通过利用2种不同的实验方法——细胞骨架染色法和胶原收缩法，从细胞水平观察了尼古丁对大鼠主动脉VSMCs的收缩作用，为治疗尼古丁所致的相关心血管疾病提供了作用靶点。