早期肺腺癌患者高分辨率CT特征对表皮生长因子受体基因突变的预测价值

王丹云 杨旭东 彭忠民

原发性肺癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其发生率呈现逐年上升的趋势。我国肺癌发病和死亡人数，2010年为60万和48万，2015年为73万和30万[1]，国家癌症中心发布的最新资料显示，肺癌发病位于全国恶性肿瘤首位，年发病约78.1万[2]。腺癌是肺癌最常见的组织亚型，约占肺癌的以50%以上[3]。确定肺腺癌中存在表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)等基因突变，以EGFR基因突变等为治疗靶点的药物使用能显著提高肺癌患者的生存期，改善预后。亚裔、非吸烟、女性、肺腺癌作为肺癌EGFR基因突变的预测因子能够有助于EGFR酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)早期应用[4-5]。

肺癌在临床、病理、影像和分子生物学等多方面均呈现出肿瘤异质性。肿瘤的影像学表现可在一定程度上反映肿瘤的分子微观特征，比如原位腺癌(adenocarcinomainsitu, AIS)和不典型腺瘤样增生(atypical adenocarcinoma hyperplasia,AAH)的CT特征：AAH具有直径<5 mm的GGO，有时需要在HRCT上才能显示，可长期稳定不变；AIS表现为pGGO，在HRCT上密度比AAH稍高，其一般直径<2 cm。相关研究认为贴壁为主型浸润性腺癌预后好，而且pGGO淋巴结转移少，楔形切除或肺段切除预后与肺叶切除预后无显著差异[6-7]。肺腺癌的影像特征可为手术方式的选择提供一定的参考。各种类型浸润性肺腺癌是否也有特殊影像学特征？或者说人们能否从影像学特征来推断肺癌的组织亚型及基因突变信息？近年来，肺癌影像学特征与基因突变的相关性研究成为一个新的研究热点，影像学在肺腺癌新分类提出后面临的最大挑战和任务是如何进行浸润类型、组织学亚型及基因突变预判。国内外已有部分学者就肺腺癌胸部CT征象预测EGFR基因突变的可行性进行了初步探讨，但结论尚未统一，且大多数研究对象为晚期肺腺癌病例(ⅢB和Ⅳ)。Yano等[8]认为EGFR基因突变多发生在直径<3 cm的周围性肺腺癌和G/T(实性成分大小/肿瘤大小)≥50%的女性GGO病变；Sugano等[9]认为EGFR基因突变与GGO影像特征没有相关性[9]；Lee等[10]认为EGFR中21外显子突变与GGO体积百分比相关；Togashi等[11]认为相比EGFR野生型肺腺癌，EGFR基因突变的肺腺癌更易出现弥漫性、随机性转移。基于以上背景，我们连续收集了手术切除已经行EGFR基因检测的早期(Ⅰ～Ⅱ期)肺腺癌患者的临床和影像学资料，通过分析EGFR基因突变状态与患者临床特征和CT特征相关性，探讨由肺腺癌临床特征和CT特征预测EGFR基因突变可能性，为肺腺癌的个体化治疗提供一定的理论依据。

对象与方法

一、 研究对象

1. 资料来源：收集2014年1月—2016年12月在山东大学附属省立医院普胸外科接受手术治疗的208例肺腺癌患者的详细资料，术后病理证实为Ⅰ～Ⅱ期肺腺癌。肿瘤TNM分期依照IASLC第8版TNM肺癌分期系统进行，非吸烟患者定义为终生吸烟数<100支。

2. 纳入标准：①患者初治原发性肺腺癌诊断明确；②患者均行手术治疗，术后均行EGFR基因检测；③通过调取医院信息系统(hospital information system，HIS)，确认患者病历资料完整，包括确切的年龄、性别、吸烟史、组织病理类型、血清癌胚抗原、肿瘤TNM分期、肿瘤家族史等临床资料。④通过调取医院影像归档和通信系统(picture achiving and communication systems,PACS)，确认存在完整的术前HRCT等资料。

3. 排除标准：①多原发性肺癌、继发性肺癌及既往恶性肿瘤病史患者；②行EGFR基因检测前进行过放疗或(和)化疗；③临床资料不完整。

二、 研究方法

1. 术前PACS资料分析：由一名高年资胸外科医师及一名高年资影像医师采用单盲法复习208例明确诊断为原发性肺癌患者的术前PACS中的HRCT图像。设置纵隔窗(窗位：20～40 HU，窗宽：300 HU)，肺窗(窗位：500～700 HU，窗宽：1 500～2 000 HU)。实性结节定义为在HRCT图像上表现为均质软组织密度灶,病灶内肺的血管、支气管均不能显示；亚实性结节定义为所有含GGO的肺结节。依据内部有无实性成分分为pGGO和mGGO。pGGO在HRCT上表现为肺内局灶性密度增高区域,在此区域内肺的血管、支气管仍能清楚显示。mGGO在HRCT上表现为实性和磨玻璃两种成分[12]。分析要点：是否存在GGO；G/T比值(定义为肺窗中GGO中实性成分最大直径与GGO最大直径之比[9])；是否有毛刺；是否有分叶；是否有胸膜凹陷征；是否有血管聚束征；是否有空气支气管征或空泡。

2. 术后EGFR基因检测：使用目前临床广泛应用的扩增受阻突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS-PCR)法检测EGFR热点突变基因(18、19、20、21外显子)的突变情况。按照试剂盒(德国产QIAamp DNA Mini Kit)说明从常规石腊切片中提取DNA，依照试剂盒(上海中山公司提供的EGFR基因突变检测试剂盒 PCR-荧光探针法)说明设计引物操作经PCR扩增，最后将产物纯化，测序仪测序。EGFR基因突变包括有效突变和无效突变。本研究将EGFR有效突变定义为突变型，EGFR无效突变(T790M)和无EGFR突变定义为野生型。

三、 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计学分析。分析整理数据后导入软件。采用χ2检验以及Fisher精确概率法分析EGFR基因突变与临床特征的关系相，利用多变量Logistic模型分析EGFR基因突变与CT特征的相关性。应用Logistic回归模型对有统计学意义的临床特征和CT特征进行多因素分析，计算相对危险度(RR)及95%置信区间(95%CI)并绘制EGFR基因突变的ROC曲线，同时计算相应的曲线下面积(AUC)。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、 EGFR基因突变与临床特征的关系

208例肺腺癌临床特征与EGFR突变关系见表1。208例手术切除腺癌中，98例EGFR突变阳性，其中女性66例，男性32例；81例无吸烟史，17例有吸烟史。EGFR总突变率为47.16%(98/208)；女性病例突变率显著高于男性病例为55.0%(P=0.008)；无吸烟史者突变率显著高于有吸烟史者(P=0.006)；患者年龄、肿瘤分化程度、血清癌胚抗原、术后病理分期等与EGFR基因突变无关(均P>0.05)。

二、 EGFR基因突变与病理组织亚型的关系

208例肺腺癌组织病理亚型与EGFR基因突变的关系见表2。EGFR基因突变最常见于贴壁为主型腺癌，其次为腺泡为主型腺癌和乳头为主型腺癌，EGFR基因突变在实体为主型腺癌中较为少见。

三、EGFR基因突变与HRCT特征的关系

208例肺腺癌HRCT特征与EGFR基因突变的关系见表3。入组208例手术切除腺癌中，含GGO病变的EGFR突变率显著高于实性结节(P=0.018)；对含GGO病变进一步行亚型分析，与G/T<50%病变比较，G/T≥50%病变EGFR突变率较高，但两者差异无统计学意义(P=0.485)。病变含有支气管充气征、无吸烟史患EGFR突变率较高为60%，不含支气管充气征的EGFR突变率为39.1%，两者差异具有统计学意义(P=0.008，P=0.006)；HRCT特征中毛刺、分叶、胸膜凹陷征、血管聚束征等与EGFR突变无明显相关性(均P>0.05)。

四、 临床和HRCT特征对EGFR基因突变的预测价值

为了构建具有临床变量和CT特征的模型，将单变量分析中发现有统计学意义的指标纳入多因素分析(表4)。在多变量Logistic回归分析中，EGFR基因突变的影响因素包括不吸烟者、含有GGO病变、含有空泡征/支气管充气征和贴壁为主型腺癌。将多因素分析中具有统计学差异的4个变量纳入Logistic回归模型，依照EGFR基因突变预测概率绘制ROC曲线，AUC为0.746，95%CI为0.639～0.778(P<0.001)(图1)。

表1 208例肺腺癌临床特征与EGFR基因突变的关系[n(%)]

表2 208例肺腺癌组织亚型与EGFR突变关系[n(%)]

表3 208例肺腺癌HRCT特征与EGFR突变关系[n(%)]

表4 肺腺癌CT征象与临床变量的多元Logistic回归分析

图1 临床特征和CT特征预测肺腺癌EGFR基因突变的 ROC 曲线

讨 论

近10年来，随着高分辨率CT(high resolution CT，HRCT)广泛使用于肺癌患者的筛查，发现肺癌的疾病谱发生明显变化即，从“中心型肺癌”向“周围型肺癌”的转变、肺鳞癌向肺腺癌的转变、晚期病变向早期病变的转变、单一病变向多发病变的转变。肺腺癌HRCT影像中纯磨玻璃影(pure ground-glass nodule，pGGO)和混杂性磨玻璃影(mixed ground-glass opacit，mGGO)的大量出现使肺腺癌的CT特征谱出现新的变化。但早期肺癌预后较好且靶向基因检测尤其是二代基因检测价格昂贵，EGFR等基因检测的性价比限制了早期肺腺癌靶向基因检测的应用。

EGFR基因是目肺癌众多驱动基因中前研究最多、证据最充分、了解最透彻的一个分子靶点。早期多项研究证实EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)(吉非替尼、厄洛替尼、凯美纳)对EGFR基因胞内结果域存在突变的非小细胞肺癌患者疗效显著，可显著改善其生存期及生活质量[13-14]。开展EGFR基因检测是个体化靶向治疗的基础和前提，组织标本检测EGFR突变是应用EGFR-TKI的“金标准”，但临床实践中因众多原因无法行EGFR基因检测。国内外针对肺腺癌胸部CT征象与EGFR基因突变相关性研究的对象大多为晚期患者，检测标本为手术标本与穿刺活检标本混杂，所得结论尚未统一。

本研究应用ARMS法检测Ⅰ～Ⅱ期肺腺癌连续手术切除标本EGFR基因突变情况，突变率为47.16%，稍低于中国2010年参与的Ⅲ期临床试验(亚洲PIONEER研究)送检肺腺癌EGFR突变率(总突变率为51.4%，中国提供肺腺癌突变率为50.2%)[15]。其原因可能与地区差异和检测方法等有关。肺腺癌临床特征与EGFR基因突变关系的分析结果与既往研究一致，女性、不吸烟是肺腺癌EGFR基因突变的优势人群。在HRCT特征与EGFR基因突变相关性分析中，病变含有GGO成分及空泡或支气管充气征与EGFR基因突变有关，而与病变是否伴有毛刺、分叶、胸膜凹陷征、血管聚束征等特征无明显关系。

少有研究探讨EGFR基因突变与含有GGO影像特征肺腺癌的关系，其结论也不一致。GGO病理基础是肿瘤细胞沿肺泡壁伏壁生长蔓延，而不破坏肺的支架结构，导致肺泡壁增厚、肺泡腔缩小，且因细小支气管不全梗阻，肺泡腔内存留部分液体和气体，根据成像原理，增厚的肺泡壁以及肺泡腔内部分液体和部分残留气体共同构成了这种特征征象。日本学者Sugno等[9]分析136例手术切除腺癌EGFR基因突变与影像特征的关系，他们认为肺腺癌EGFR基因突变与GGO、毛刺征等均无显著相关，但男性且含有GGO的肺腺癌患者EFGR基因突变率高于不含GGO男性患者，这与美国学者Glynn等[16]的研究结论一致。日本学者Park等[17]的研究在265例初治晚期肺腺癌(ⅢB～Ⅳ期)中发现159例伴有EGFR基因突变(60%)，其认为EGFR基因突变与GGO病变相关。日本学者Hasegawa等[18]的研究在363例肺腺癌中检测EGFR基因突变率为39.2%，其认为EGFR基因突变更多见于双肺多发转移、伴有GGO成分、血管聚束征、Ⅴ型凹陷(肚凹征)，较少伴空洞和胸腔积液。台湾学者Hsu等[19]分析162例Ⅰ期肺腺癌影像学特征与EGFR基因突变的关系，他们认为EGFR基因突变在实性肿瘤中多见，在pGGO病变中少见，尤其是21外显子的L858R点突变。而日本学者Usuda等[20]认为pGGO及mGGO中EGFR基因突变更常见，国内学者Zou等[21]对209早期肺腺癌EGFR突变与CT特征的研究也认为EGFR基因突变在pGGO及mGGO中较实性肿瘤高，这与我们的研究结果一致。

关于病灶GGO成分的亚组分析，不同研究所用参数不同，包括直径比(实性最大直径与GGO最大直径比)[8-9,22-23]、面积比(最大直径层面上纵隔窗面积与肺窗面积比)[20]、容积比(纵隔窗体积与肺窗体积比)[10,24]、肿瘤消散率(即肺窗面积和纵隔窗面积之差与肺窗面积之比)[19,25-26]。我们的研究采用临床适用最方便快捷的直径比，不需要特殊的软件进一步处理。日本学者Aoki等[23]将pGGO至实性结节依直径比分为4个级别，结果证实含有GGO病变中随着实性成分的比例增高，其EGFR基因突变率越高。德国学者Lee等[10]的研究认为病变GGO容积比在外显子21缺失者显著高于野生型和外显子19突变者，随着GGO容积比的增多，21外显子缺失突变率随之增加。而国内Yang等[24]的研究认为GGO容积比与EGFR基因突变没有相关性。韩国学者Hong等[22]的研究对250例手术切除肺腺癌进行EGFR基因检测，结果显示EGFR基因突变率为46.8%，其认为EGFR基因突变常见于含有GGO病变，GGO直径比在50%以上者较以下者更易突变，外显子19及21突变者较野生型更常见含有GGO，这与我们的研究结果一致。有意思的是，他们对其中194例行PET-CT显像检查的结果进行分析，认为EGFR突变者与野生型的最大标准化摄取值(SUVmax)无差异，而韩国学者Cho等[27]对61例非小细胞肺癌(57例腺癌)进行肿瘤组织EGFR基因检测、血清肿瘤标志物测定(CYFRA 21-1、CEA和SCCA)及PET-CT显像，结果显示EGFR基因突变率为50%，认为女性、高水平的CYFRA21-1和较低的SUVmax(可以预测EGFR突变。最近国内一个大样本队列研究回顾性分析了849例18F-FDG PET-CT对非小细胞肺癌EGFR突变预测情况，结果显示低pSUVmax(原发肿瘤SUVmax)与EGFR基因突变相关[28]。

对其他HRCT特征与EGFR突变关系的结论也不一致。结节内透亮影有时难以确定是空泡征、空洞征还是空气支气管气征。空泡征是指病灶内1～2 mm(或<5 mm)的点状透亮影，单个或多个肺窗下观察为小泡状模糊低密度灶，纵隔窗为小泡状透亮影。按照空泡征的定义，病灶直径5 mm以内;直径>5 mm考虑是空洞。支气管充气征是见于连续多个层面，直达结节外缘。其病理基础是扩张的细支气管。空泡征病理基础就是尚未被肺癌侵犯的残余正常肺组织(肺泡或小支气管)，其大小与肺癌的生长方式有关。空洞的病理基础是肿瘤生长速度较快，超过肿瘤血供；肿瘤坏死后，坏死物被支气管引流后残留的空腔。本研究不严格区分空气支气管征与空泡征。意大利学者Rizzo等[29]对280例非小细胞肺癌检测的EGFR突变率为21.43%，其认为EGFR突变常见于女性、非吸烟者、小病灶、含有支气管充气征、胸膜凹陷征及缺乏纤维化者。中国台湾地区学者Hsu等[30]对149例晚期肺癌CT特征和EGFR状态进行了分析，结果示EGFR基因突变率为52.3%，EGFR基因突变常见于卵圆形病灶，21外显子突变者直径大于19外显子删除突变，支气管充气征常见于19外显子删除突变，野生型和21外显子突变少见，钙化常见于野生型。国内天津肿瘤医院Liu等[31]对385例肺腺癌进行CT特征分析，EGFR基因突变率为43.6%，EGFR基因突变多见于不吸烟伴小病灶、小泡征、均匀强化、胸膜凹陷、血管聚束征。本研究证实EGFR突变状态与HRCT特征中含有GGO、支气管空气征/空泡征相关，相关文献与本文结果的差异可能与研究样本大小及HRCT特征分布有关。研究结果也可能归因于研究人群的种族和肿瘤分期的差异。

本研究中女性、非吸烟、贴壁为主型腺癌、病变含有GGO、支气管空气征/空泡征与EGFR基因突变状态相关。多因素分析中非吸烟、贴壁为主型腺癌及病变含有GGO及空泡征/空气支气管征是影响EGFR突变的独立因素。采用ROC曲线评价临床特征及HRCT特征诊断早期肺腺癌EGFR基因突变的价值，4个指标预测早期肺腺癌EGFR突变状态的AUC为0.746，说明这4个因素可以提供相对良好的预测EGFR突变状态的性能。

本研究不同于以往关于肺腺癌EGFR基因突变状态与HRCT特征的研究。首先，本研究对象是早期肺腺癌，大部分患者为Ⅰ期(110/208，52.9%)，这与当前肺癌疾病谱一致。其次，本研究定义肺腺癌EGFR基因突变状态为有效突变，紧密结合临床治疗。将浸润性腺癌依照分化程度分为低、中生长模式(贴壁、腺泡和乳头)和高生长模式(固体或微乳头)，其结果从侧面证实了分化程度不能够预测EGFR基因突变状态。本组208例手术切除的早期肺腺癌患者没有接受术前化疗干预，这可能使放射基因组学与肺腺癌中EGFR突变状态的相关性更加精确。

本研究有几个局限性。首先，研究样本量偏小，其中有许多患者的术前影像学检查在院外完成，其结果不可用。其次，HRCT图像的一致性解释，未对观察者之间的差异进行评估，在评价HRCT特征时仅评价了没有争议的指标，舍弃了有争议的指标；本研究直接使用直径比评价GGO比例，没有使用二维测量或专用软件来估计GGO的体积。第三，因为早期病例没有行KRAS、ALK、ROS1等基因检测，这将在进一步研究中加以完善。第四，回顾性研究可能引入偏倚，包括患者选择偏倚和样本可用性偏倚，高级别的循证医学证据尚需多中心、大样本、长时间的深入研究。

综上所述，在早期肺腺癌HRCT特征中，病变含有GGO及支气管充气征/空泡征的EGFR突变率高，结合不吸烟、贴壁为主型等临床病理特征可有效预测病变的EGFR突变状况。