补肾壮筋汤调节miR-140抑制脂多糖介导软骨细胞IL-1β、TNF-α表达的研究

贾良良 ，陈 达 ，2，许丽梅 ，李 慧 ，曾建伟 ，叶锦霞 ，王丽丽 ，叶蕻芝 ，4，李西海 ，4

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省康复技术重点实验室，福建 福州 350003；3.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；4.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是在生物因素与生物力学因素相互联合、共同作用下出现的生物学紊乱最终导致的病变结果［1］，好发于中老年人，严重影响患者的生活质量，已成为医学界关注的焦点问题。炎症反应介导的软骨基质表达紊乱是OA的关键病理过程［2］，白细胞介素 1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）是引起基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）等高表达的关键因素［3］，从而导致蛋白多糖、Ⅱ型胶原合成和降解之间的稳态失衡。基于肝肾亏虚则筋骨失养是骨关节炎的病理基础，临床上中药复方治疗骨关节炎多从肝肾论治，并配合随证加减，其疗效可靠。药效成分的复杂多样是中药复方多靶点治疗骨关节炎的物质基础，也是探索天然药物治疗骨关节炎作用机制研究的重点领域。课题组前期研究发现，补肾壮筋汤具有多层次、多途径抑制骨关节炎筋骨失养的作用，但其具体的作用靶点尚不清楚。微小RNA（miRNA）是基因表达调控的关键因素，也是筛选骨关节炎治疗靶点研究的热点。因此，本研究以miR-140介导软骨基质稳态失衡为切入点，初步探讨补肾壮筋汤调控软骨基质稳态失衡、抑制骨关节炎筋骨失养的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级4周龄雄性SD大鼠，体质量（200±10）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK（沪）2012-0001。

1.2 实验试剂与仪器 补肾壮筋汤方药（福建中医药大学国医堂）；U0126（美国 CST公司）；脂多糖（LPS）、Ⅱ型胶原酶（美国 Sigma 公司）；甲苯胺蓝（ 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 ）；TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒（美国R&D公司）；低糖DMEM培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清FBS（美国Gibco公司）；MMP-13抗体、彩色预染蛋白 marker（美国Thermo Fisher 公 司 ）；MMP-13、MMP-3、ADAMTS5抗体（美国 Santa Cruz公司）；β-actin抗体（美国Abcam公司提供）；二抗：羊抗兔（北京中杉金桥生物技术有限公司）；封闭用羊血清（北京索莱宝科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液（强）、Trizol（上海碧云天生物技术有限公司）；mRNA提取试剂盒、miR-140引物、miRNA提取试剂盒（美国Taqman公司）；化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）；9600 DNA扩增仪（美国PE公司）；7500型实时定量PCR仪（美国ABI公司）

2 实验方法

2.1 软骨细胞鉴定 取4周龄SPF级SD雄性大鼠膝关节，于超净台分离膝关节，将手术刀片剥离的胫骨平台及股骨髁软骨置于含有PBS的培养皿中，切成1 mm3大小的块状。PBS漂洗后加入0.2%的Ⅱ型胶原酶消化软骨，置恒温孵育箱（5%CO2），2 h／次收取上清，1 000 r／min 离心 5 min，将细胞沉淀中加入4 mL培养液置于恒温孵育箱，48 h更换培养液。此为获取的原代软骨细胞。原代软骨细胞长至90%时，传代，第二代软骨细胞，以1×105个／mL接种于含有细胞爬片的6孔板中。二代软骨细胞培养72 h后，PBS漂洗，经4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗，经甲苯胺蓝（1%）浸染10 min，最后以无水乙醇漂洗，待晾干，中性树脂封片；同法，经多聚甲醛（4%）固定 30 min，PBS 漂洗，封闭 30 min，吸净封闭液，阳性组为软骨细胞孵育ColⅡ（4℃过夜），而阴性组为不加有ColⅡ 孵育（4℃过夜）的软骨细胞，PBS洗涤，室温下孵二抗，PBS洗涤，DAB显色4 min左右，苏木素浸染10 s左右，流水清洗，待晾干，中性树脂封片，于光学显微镜下形态学观察。

2.2 造模与干预 本实验炎症软骨细胞模型，为经10 ng／mL的LPS干预对数生长期的二代软骨细胞（长至90%）8 h诱导。培养的二代软骨细胞分为正常组、模型组、抑制剂组、氨基葡萄糖组和补肾壮筋汤组。空白组，常规培养；模型组，加LPS 10 ng／mL；抑制剂组，加 U0126 10 ng／mL干预 30 min，加 LPS 10 ng／mL；氨基葡萄糖组，加氨基葡萄糖 1.35 μg／mL＋LPS 10 ng／mL；补肾壮筋汤组，加补肾壮筋汤200 μg／mL＋LPS 10 ng／mL，各组干预 8 h。

2.3 炎性因子检测 收集各组干预8 h后的细胞上清液，按IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒说明书处理细胞上清液并严谨操作，用多功能酶标仪（波长为450 nm）检测各组细胞上清液中IL-1β、TNF-α的表达量。

2.4 Western blot法检测软骨细胞相关蛋白表达采用RIPA裂解液提取细胞蛋白，BCA法测样本蛋白浓度。吸取20 μg蛋白样品上样，经电泳、转膜后室温封闭1 h，弃封闭液，4℃下分别与MMP-3、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5、RAF 和 β -actin（1∶1 000）一抗孵育过夜，用 TBST 洗膜；孵二抗（1∶2 000），摇床室温孵育 1 h，用 TBST 摇床洗膜；于ECL显影液下反应1 min，曝光、显影。用Image Lab软件分析获取各蛋白条带灰度值。

2.5 qRT-PCR检测软骨细胞mRNA表达 采用Trizol一步法常规提取关节软骨总RNA，测定RNA样本浓度，逆转录。本实验引物序列采用Primer 5软件设计：MMP-3上游5'-GGAGTAATCGCATTGT GAGAGTC-3'，下游 5'-GGTTCCAGCCACGCATAGT C-3'；MMP-13 上 游 5'-ATGATGATGAACGATGGA CAGATG-3'，下游 5'-TGCTACACATTGGTAAGGTC TCAG-3'；ADAMTS4 上游 5'-GCAGAGTCCGAACG AGTTTACG-3'，下游 5'-TAGTGCCAGTTCTGTGCG TCG-3'；ADAMTS5 上游 5'-GTCTCAGCATTGACCT TCCGTG-3'，下游 5'-ACAGGGAGTTCCATCTGCCA CC-3'；RAF 上游 5'-AGACGAATGGAAGAGCCTGA-3'，下 游 5'-GGGATGGACAGAACAGAAGC-3'；GAPDH上游 5'-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3。反应体系：QRT-PCR SYBR Green Master Mix 10.5 μL；上游引物 0.5 μL；下游引物 0.5 μL；cDNA 2 μL；超纯水6.5 μL。 反应条件：95 ℃ 5 min，预变性；95 ℃10 s，变性，60℃ 34 s，退火延伸，行40个循环扩增。同时注意扩增曲线趋势走向，以2-△△CT相对定量法计算各mRNA相对表达量。

2.6 qRT-PCR检测软骨细胞miR-140表达 按照miRNA提取试剂盒说明书操作，提取大鼠软骨细胞中总 miRNA，逆转录后取 10 ng（5 μL）的总miRNA，进行 qRT-PCR反应。反应体系：2×TaqMan Universal PCR Master Mix，10.0 μL；20 ×TaqMan Assay 1.0 μL；逆转录产物＋RNase-free water 9.0 μL。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，行40个循环。密切关注扩增曲线，以2-△△CT相对定量法计算miRNA-140相对表达量。

2.7 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件处理数据。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 软骨细胞鉴定 Ⅱ型胶原酶免疫组化染色显示，阳性组胞浆为棕黄色，阴性对照组胞浆未染色（图1-A、1-B）；甲苯胺蓝染色显示，胞浆内出现紫偏蓝的异染颗粒状（图1-C），提示本实验培养的细胞为软骨细胞。

图1 软骨细胞鉴定（×200）

3.2 5组软骨细胞IL-1β和TNF-α表达量的比较见表1。

3.3 5组软骨细胞相关蛋白表达 见图2。

3.4 5组软骨细胞相关基因表达 见图3。

3.5 5组软骨细胞miR-140的表达 与正常组相比，模型组 miR-140表达显著降低（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组相比，抑制剂组、氨基葡萄糖组和补肾壮筋汤显著升高（P＜0.01，P＜0.05），见图 4。

4 讨 论

基于肝肾亏虚、筋骨失养是OA的病理基础，结合中医骨伤“筋-骨”的病机演变规律，提出OA的治则以补肾柔肝为主（治痿），辅以活血祛风（治痹）［4］，采用补肾壮筋汤，以熟地黄、山茱萸为君，奏滋补肝肾、填精益髓之功；续断、杜仲、五加皮为臣，助君补肝肾，又可强筋骨；当归、白芍、茯苓及青皮共为佐，以活血敛阴，疏肝理气；牛膝为使，可活血通经，引药入经，直达病所，又可强筋骨，补肝肾，诸药共奏补肾柔肝之效。

表1 5组软骨细胞IL-1β和TNF-α 的表达量（x±s）pg／mL

图2 补肾壮筋汤干预后5组软骨细胞相关蛋白表达

图3 补肾壮筋汤干预后5组软骨细胞相关基因表达

图4 补肾壮筋汤干预后软骨细胞miRNA-140表达

在OA病程中，TNF-α不仅有效调节IL-1β的表达，可引起前诱导炎症反应，所以TNF-α、IL-1β有“前炎症因子”之称［5］。 IL-1β 可诱导基质降解酶MMPs和ADAMTS的表达，ADAMTS5的表达量增加与软骨基质降解成正相关，在OA的形成过程中发挥重要作用［6-7］。IL-1β通过上调MMP-3的表达，使软骨基质合成减缓，最终引发软骨退变［8］。在胶原蛋白降解中，MMP-3发挥重要作用，其可激活放大MMP-13对软骨基质的降解能力，MMP-3、MMP-13会致使Ⅱ型胶原降解，使关节软骨的损伤加重［9］。研究表明，氨基葡萄糖可抑制血清中MMP-3的表达［10］，刺激软骨细胞再生，进而改善关节软骨结构，达到软骨组织修复的作用［11］。研究表明，补肾壮筋汤可减轻炎症反应，抑制TNF-α、IL-1β在血清中的表达，使软骨基质降解受到抑制，延缓软骨退变发生及骨赘的形成进程［12］。本实验采用LPS（10 ng／mL）干预软骨细胞8 h，建立软骨细胞炎症模型［13］。本研究发现，补肾壮筋汤和氨基葡萄糖均可下调TNF-α、IL-1β的表达，使RAF表达受抑制，进而使MMPS和ADAMTS的表达下降，说明二者均可有效延缓炎症反应，抑制软骨基质降解，延缓OA的病理进程。

在MAPK信号通路中，ERK1／2通路为其下游的一支，当受外来刺激时RAS首先被激活，产生串连式反应，被活化的RAS继而激活RAF，进而激活MEK1／2，使 p-ERK1／2 产生活化［14］，进而进入细胞核，激活转录因子及基质金属蛋白酶的表达，从而引起软骨的病变，最终形成 OA［15］。 因此，ERK1 ／2信号的活化对软骨细胞病变起关键作用［15］。ERK1／2信号通路中，其特异性抑制剂可下调IL-1β等炎性因子的分泌［16］。RAF作为 ERK1／2通路的重要组成部分，其表达量的变化对OA起重要作用。本研究所用U0126为MEK特异性抑制剂，通过调控ERK1／2信号通路抑制TNF-α、IL-1β的表达，使MMPS和ADAMTS表达下降。本实验结果显示，补肾壮筋汤下调软骨细胞炎症模型 ADAMTS4、ADA－MTS5、MMP-3、MMP-13和RAF的表达，说明补肾壮筋汤可抑制炎症介导的软骨基质稳态失衡。

miR-140是miRNA家族成员之一，可调节软骨细胞的功能，以维持软骨基质的内稳态。体外培养软骨细胞，炎症因子IL-1β高表达可抑制miR-140表达，而miR-140的高表达对IL-1β的产生有下调效果［16］，说明二者存在着相互作用的关系。此外，miR-140还能负向调控MMP-13、MMP-3的表达，miR-140表达的降低，MMP-13、MMP-3的表达会升高进而加快蛋白多糖和Ⅱ型胶原的降解［16］。本研究显示，补肾壮筋汤组miR-140表达显著升高，提示补肾壮筋汤通过上调miR-140表达，抑制炎症反应介导软骨基质稳态失衡，但miR-140与炎症因子的具体调节机制有待深入研究。

补肾壮筋汤中化合物具有良好的多样性，既含有类药性质，又是天然产物化合物的一个特殊子集，提示其成分的多样性和复杂性，本研究仅仅初步探讨miR-140是补肾壮筋汤调控软骨基质稳态失衡的重要靶点，而其药效物质基础与复杂调控网络有待于今后的深入研究。