丹参多酚酸盐对内皮祖细胞衰老和端粒酶活性的影响

陈永忠，陈 慧，林秀明，陈 成

（福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003）

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是外周循环中内皮细胞的前体细胞，具有内皮再生能力，可以黏附于血管内皮损伤处，分化为成熟的内皮细胞，参与血管损伤修复，多种因素可促进EPCs的衰老和细胞凋亡［1］。端粒是位于真核细胞染色体末端的一段DNA-蛋白质复合体，细胞的每一次分裂，均会出现染色体末端DNA片段的丢失，端粒像一顶“帽子”保护着染色体DNA的完整和稳定，当端粒缩短到一定程度就会出现染色体DNA损伤，从而引发细胞衰老、凋亡［2］。端粒酶是一种能延长端粒末端的逆转录酶，主要由端粒酶RNA（TERC）和端粒酶逆转录酶（TERT）组成。端粒酶以自身RNA为模版，在端粒末端合成新的DNA重复序列，以补偿细胞分裂时端粒的缩短。因此，端粒酶活性是调控细胞衰老和凋亡的关键点。有研究发现丹参多酚酸盐能抑制EPCs的衰老和凋亡［3］，但其中的机制尚不明确。本研究基于端粒酶活性探讨丹参多酚酸盐调控内皮祖细胞衰老的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 丹参多酚酸盐（上海绿谷制药有限公司，批号18040322）；乙酰化低密度脂蛋白（DilacLDL）、FITC 标记的荆豆凝集素-I（FITC-UEA-I）（美国Sigma公司）；EGM-2培养基、磷酸缓冲盐溶液、淋巴细胞分离液、SA-β半乳糖苷酶染色试剂盒、冷丙酮、EDTA、Tris、dNTP、寡聚核苷酸（杭州格唯科技有限公司）；dATP、dGTP、TaqDNA 聚合酶（美国Promega公司）。

1.2 实验仪器 流式细胞仪（Beckman-Coulter公司）；显微镜（Olympus公司）；二氧化碳细胞培养箱（Panasonic公司）。

1.3 人外周血EPCs的分离和培养 取健康成人外周静脉血50 mL，每毫升血以0.1 mg肝素抗凝。血液样本用磷酸缓冲盐溶液进行等倍稀释，加入淋巴细胞分离液后以2 000 r／min离心20 min，吸取血浆与分离液交界处的白色细胞层，加入磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，接种于纤维连接蛋白包被的培养板上，加入EGM-2培养液，在恒定温度37℃、二氧化碳浓度5%、饱和湿度95%的培养箱中培养，每2 d换液1次，用倒置相差显微镜观察贴壁细胞。第10天收集培养瓶中贴壁生长的梭形细胞进行鉴定。

1.4 EPCs鉴定 收集细胞后加入10 μg／mL的DiL-acLDL，在恒定温度 37℃、二氧化碳浓度5%、饱和湿度95%的培养箱孵育4 h后，室温下冷丙酮固定8 min，用磷酸缓冲盐溶液漂洗2次，加入10 μg／mL的FITC-UEA-1室温下孵育1 h。共聚焦显微镜下DiL-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性的细胞鉴定为正在分化的EPCs。

1.5 分组和干预 将培养14 d所得的EPCs随机分成4组：对照组、低浓度组（丹参多酚酸盐1 mg／L）、中浓度组（丹参多酚酸盐5 mg／L）、高浓度组（丹参多酚酸盐 10 mg／L），在 37 ℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱中加药共培养。

1.6 检测EPCs增殖能力 将干预24 h后的EPCs接种于包被有纤维连接蛋白的96孔培养板中，每孔加入 10 μL MTT（5 g／L）培养 4 h，吸除上清液后每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡 10 min后置酶标仪上，于波长490 nm处测各孔光吸收度值（A490），了解 EPCs的增殖能力。

1.7 检测EPCs黏附能力 用0.25 g／L胰蛋白酶消化收集干预24 h后的EPCs，悬浮在500 μL培养液中吹打均匀并计数，然后将同等数目的EPCs接种在包被有明胶的培养板，在恒定温度37℃、5%CO2、饱和湿度95%的培养箱培养30 min，取3个高倍镜视野（×200）计数贴壁细胞，了解EPCs的黏附能力。

1.8 评价EPCs衰老的情况 采用SA-β半乳糖苷酶染色法判断EPCs衰老的情况，将共培养24 h后的EPCs接种于6孔板，吸除细胞培养液，用磷酸缓冲盐溶液洗涤1次，加入1 mL半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。吸除细胞固定液，用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞3次，每次3 min。吸除磷酸缓冲盐溶液，每孔加入1 mL染色工作液。恒定温度37℃孵育过夜，用保鲜膜封住孔板防止蒸发。高倍镜视野（×200）下计数10个典型视野的衰老细胞数。

1.9 采用错配有限延伸法检测端粒酶活性 参照文献［4］，各组分别干预EPCs 72 h，用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，收集细胞，去除磷酸缓冲盐溶液，冷裂解缓冲液中加入终浓度为200 U／mL的RNA酶抑制剂，0.1 mmol／L 的苯甲脒和 1 mmol／L 的二硫苏糖醇，加入200 μL上述含抑制剂的冰裂解缓冲液，悬浮细胞沉淀，漩涡震荡10 s，冰浴30 min，其中间隔数分钟，漩涡震荡1次，共5次；4℃下12 000 r／min 离心 20 min（离心半径为 8 cm），吸取约160 μL的上清液（端粒酶提取物），转移至新的离心管中，每管分装20 μL，进行下一步PCR实验。端粒酶提取物加入1×TRAP缓冲液（20 mmol／L Tris-HCl，pH 8.3，1 mmol／L EDTA，0.05%Tween 20，63 mmol／L KCl，0.1 mg／L BSA，1.5 mmol／L MgCl2）、50 μmol／L脱氧腺苷三磷酸（dATP）和脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、1 μmol／L 端粒酶底物，在 30 ℃条件下反应30 min，然后在94℃下灭活5 min。再加入50 μmol／L 的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、2 U TaqDNA 酶 ，1 μmol／L 长链引物，在 60 ℃条件下反应10 min。加入下游引物，第一阶段94℃持续30 s，50℃持续60 s，72℃持续90 s，进行2个循环；第二阶段94℃持续30 s，60 ℃持续 30 s，72 ℃持续 30 s，进行30个循环。然后加入250 μL封闭液37℃下封闭 30 min 后，100 μL 封闭液＋5 μL TRAP 反应产物在37℃下孵育1 h，加入100 μL终止液振荡。在酶标仪上，以 690 nm作为参比波长（A690），测定样品在450 nm波长的吸光度值（A450）。差值ΔA＝A450－A690，代表细胞端粒酶活性。

1.10 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计处理。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析检验。

2 结 果

2.1 EPCs的形态变化 培养初期均为单个核细胞，培养至第5天出现梭形细胞，第10天出现呈集落样贴壁生长的梭形细胞，之后细胞迅速扩增，至第14天细胞簇形成“铺路石样”，见图1。

图1 不同培养时间EPCs形态图（×200）

2.2 EPCs鉴定 共聚焦显微镜下DiL-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性，可鉴定培养所得的细胞为正在分化的EPCs，见图2。

图2 EPCs鉴定图（×200）

2.3 4组EPCs增殖、黏附能力、衰老和端粒酶活性的比较 见表1。

3 讨 论

在正常情况下血管内皮损伤与EPCs修补之间存在动态平衡，维持内膜完整性，而EPCs的数量减少、功能下降会导致内皮损伤的修复不足，动脉管腔裸露，启动和加速动脉粥样硬化的进程。EPCs功能与衰老也密切相关，细胞衰老是细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程［1］。丹参多酚酸盐是丹参最重要的有效活性成分，具有抗动脉粥样硬化、抗炎、抗肿瘤、抗氧化损伤等多种药理作用［5］。研究发现丹参多酚酸盐能够修复糖基化终产物引起的EPCs功能障碍［6］。丹参及其提取物丹参多酚酸盐可能通过改善EPCs功能达到促进血管新生的作用［7］。

表1 4组EPCs增殖、黏附能力、衰老和端粒酶活性的比较（x±s）

本研究显示，丹参多酚酸盐能促进EPCs的增殖，提高EPCs的黏附能力，且与药物浓度相关，以5 mg／L浓度作用最强。随着丹参多酚酸盐浓度的增加，EPCs功能并没有获得更大的提高，反而有减弱倾向，与“少火生气，壮火食气”颇有异曲同工之妙，提示适量的丹参多酚酸盐来活血化瘀可以改善EPCs的功能，从而促进血管内皮损伤的修复和血管新生，是动脉粥样硬化性疾病的一个治疗思路。同时，丹参多酚酸盐的剂量并非越大越好，适量可取得最佳效果。

有研究显示，端粒结构被破坏后会促进内皮细胞衰老，细胞黏附因子1表达升高，内皮一氧化氮合酶活性下降，导致内皮功能紊乱；相反，过表达TERT诱导端粒酶活性增加，使得内皮细胞寿命延长并改善衰老导致的功能障碍［8］。与健康人相比，冠心病患者的冠状动脉内皮细胞的端粒缩短更加明显，且同一患者冠状动脉斑块处内皮细胞的端粒比非斑块处短，提示由端粒缩短引起的局部内皮细胞衰老和功能障碍在冠状动脉粥样硬化中发挥重要作用［9］。而端粒长度依赖于端粒酶的调控。端粒酶缺陷的小鼠模型表现出干细胞耗竭、器官系统功能衰竭和组织再生修复能力下降等衰退表现，而内源性端粒酶再激活可以显著逆转小鼠多种组织的退行性变化，且未增加癌症的发生风险，提示端粒酶可以作为延缓衰老和治疗衰老相关疾病的潜在靶点［10］。

本研究观察丹参多酚酸盐对EPCs衰老和端粒酶活性的影响，结果显示：适量的丹参多酚酸盐可以抑制EPCs衰老，但是对端粒酶活性并没有明显影响，提示丹参多酚酸盐的抗细胞衰老作用途径可能不是通过影响端粒酶活性实现的，结合细胞衰老的氧自由基学说、分子交联学说等理论，考虑丹参多酚酸盐的抗细胞衰老作用可能是通过其他途径实现的，有待下一阶段的研究进一步明确。从另一角度讲，丹参多酚酸盐对端粒酶活性无明显影响，那么就不会有因其抗衰老作用而导致细胞永生化、增加癌症发生风险的担忧。综上所述，适量的丹参多酚酸盐可以增强EPCs功能，延缓EPCs细胞衰老，成为动脉粥样硬化性疾病治疗的一个安全有效选择。