鉴别诊断鸡传染性法氏囊病RT-PCR方法的建立

严红亚，赵鹤庭,2，赵蓉，信爱国，常志顺*

(1.云南省畜牧兽医科学院 养禽与禽病研究所，云南 昆明 650224；2.洱源县动物疫病预防控制中心，云南 洱源 671200)

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起，主要侵害鸡淋巴组织，特别是法氏囊组织[1]。IBDV的核酸为线性双股RNA，目前普遍认为影响该病毒抗原及毒力的变异主要发生在VP2基因，其编码的结构蛋白是主要宿主保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导和识别等有关。根据毒力差异，IBDV可分成超强毒株(very virulent IBDV, vvIBDV)、经典毒株(classical IBDV，cIBDV)、变异毒株(variant IBDV, vIBDV)和致弱毒株(疫苗株)。IBD主要造成鸡的免疫抑制，引起鸡死亡或者导致感染鸡的免疫应答能力降低、抵抗力下降和生长抑制等，使其易受到其他病原的并发及继发感染，给养鸡业带来巨大的损失。

快速检测IBDV对该病的防控具有重要的意义。目前，国内 IBDV快速检测方法主要有 RT-PCR[3]、荧光定量 RT-PCR 法[4]、双抗体夹心 ELISA[5]和环介导等温扩增技术(LAMP)[6]等分子生物学方法。本文建立了特异性检测IBDV和区分IBDV超强毒株(vvIBDV)和经典毒株(cIBDV)的RT-PCR方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

传染性法氏囊病活疫苗(B87株)购自湖南中岸生物药业有限公司，鸡白痢沙门氏菌、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒均为本实验室分离鉴定保存，禽流感病毒H9血凝抗原购自哈尔滨维科生物技术开发有限公司。

1.2 主要试剂

病毒RNA提取试剂(RNAiso Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司，病毒cDNA合成试剂盒(TransScript one-step gDNA cDNA synthesis Super Mix)购自天根生化科技(北京)有限公司。PCR试剂(2×High-Fidelity Master Mix)购自上海捷瑞生物工程有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯产品。

1.3 引物合成

IBD病毒VP2基因片段为高变异区，采用文献报道的引物[2]，针对VP2基因建立IBDV通用检测和区分毒株毒力强弱的RT-PCR方法(表1)。其中引物对IBDVF/IBDVR用于IBDV检测基础PCR扩增，引物对IBDVf/IBDVr用于IBDV检测巢式PCR扩增；引物对vvIBDVF/vvIBDVR和引物对cIBDVF/cIBDVR分别用于区分IBDV超强毒株和经典毒株。引物由昆明硕擎生物科技有限公司合成。

1.4 病毒RNA提取和cDNA的合成

取200μL传染性法氏囊病活疫苗原液，用RNAiso Plus试剂提取病毒总RNA，最终溶解于40mL RNase-Free ddH2O中，-70℃保存备用。取上述所提RNA进行反转录，反转录的体系为：5×gDNA Buffer 2μL、Total RNA 8mL,42℃孵育3min，置于冰上放置。10×King RT Buffer 2μL 、FastKing RT Enzyme Mix 1μL 、IBDV通用反转录引物为随机引物，总体系为20μL；反应条件为42℃ 15min、95℃ 3min，合成的cDNA产物进行后续PCR扩增。

表1 引物信息

1.5 传染性法氏囊病PCR检测

以上述获得的cDNA产物为模板，针对传染性法氏囊病VP2基因高变区，建立IBDV检测方法。PCR反应为25μL体系：2×High-Fidelity Master Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5μL、IBDV VP2基因基础引物(IBDVF/ IBDVR)或经典毒株引物(cIBDVF/cIBDVR)、超强毒株引物(vvIBDVF/ vvIBDVR)各0.5μL、cDNA模板1μL，混匀。扩增条件：94℃ 3min、94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 30s，35个循环；72℃延伸5min。巢式PCR以第一次基础PCR产物为模板再进行PCR 扩增，巢式PCR引物为IBDVf/ IBDVr，扩增条件：94℃ 3min、94℃ 1min、60℃ 45s、72℃ 30s，35个循环；72℃延伸5min。反应结束后取5μL产物进行2%琼脂糖凝胶电泳观察和成像系统拍照分析。

1.6 特异性测定

分别提取鸡白痢沙门氏菌、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒基因组，按上述方法进行扩增，验证建立方法的特异性。

1.7 样品检测

取2份送检的疑似传染性法氏囊病样品及临床健康鸡肛拭子样品1份，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA后，采用上述方法进行RT-PCR扩增，鉴定IBDV，扩增产物进行2.0% 琼脂凝胶电泳分析。

2 结果

2.1 IBDV基础PCR 检测结果

提取病毒RNA，利用试剂盒通用检测引物获得病毒cDNA，针对IBDV VP2基因设计基础PCR引物和巢式PCR 引物进行扩增，检测IBDV。结果获得679bp 目的条带(见图1)。表明该方法能够检测出IBDV，可以用于IBDV的临床检测。

1：IBDV B87毒株阳性； 2：阴性对照

2.2 IBDV巢式PCR 检测结果

利用基础PCR 所获得的产物作为模板，进行巢式PCR 检测。获得预期471bp目的条带(见图2)。表明当样品中病毒含量较少时，巢式PCR 可用于IBDV的检测。

1：IBDV B87毒株阳性； 2：阴性对照

2.3 IBDV经典毒株和超强毒株的鉴别

提取病毒RNA，利用试剂盒通用检测引物获得病毒cDNA，针对IBDV超强毒株和经典毒株设计特异性引物进行扩增，结果获得相应的目的条带(见图3)。表明可用该方法区分IBDV超强毒株和经典毒株。

1：经典毒株； 2：超强毒株

2.4 IBDV特异性检测结果

对鸡白痢沙门氏菌、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒H9血凝抗原进行IBDV检测，结果显示上述病原检测物特异性扩增产物，说明该方法对检测IBDV具有特异性。

2.5 IBDV样品基础PCR检测鉴定结果

用建立的方法检测验证IBDV样品，通过基础 RT-PCR检测，结果显示，疑似IBDV样品基础PCR可扩增出679bp预期条带，来源于健康鸡肛拭子样品检测结果为阴性，见图4。

1、2：疑似IBDV临床样品； 3：健康鸡肛拭子；4：阴性对照

用建立的巢式PCR方法检测验证IBDV样品，结果显示，IBDV疑似样品均可扩增出471bp预期条带，来源于健康鸡肛拭子样品检测结果为阴性，见图5。说明IBDV疑似样品为传染性法氏囊病阳性，健康鸡肛拭子样品为传染性法氏囊病阴性。

1、2：疑似IBDV临床样品； 3：健康鸡肛拭子；4：阴性对照

鉴定传染性法氏囊病毒样品经典毒株和超强毒株，结果获得大小为137bp的经典毒株目的条带(见图6)，超强毒株条带为阴性(结果未显示)。说明IBDV阳性样品为传染性法氏囊病经典毒株。

1、2：IBDV阳性样品； 3：阴性对照

3 讨论

鸡传染性法氏囊病可直接引起鸡只死亡，还可损伤病鸡免疫系统，造成病鸡抵抗力下降，易受到其他多种病原微生物的感染。快速诊断和鉴别IBDV是预防控制该病的重要手段。RT-PCR方法是从基因水平检测IBDV，具有敏感性高、特异性强的特点。与常规琼脂扩散试验、病毒血清中和试验等方法相比，检测更快速、更准确[7-9]。用RT-PCR方法鉴定IBDV不需要增值病毒，在病毒含量较低时采用巢式PCR可以准确鉴定检测结果，提高检测效率。1999年陈红英等[10]采用套式RT-PCR检测IBDV，由于引物特异性不高等问题限制了在临床上的运用和推广。本实验建立了一种快速准确鉴定IBDV的方法，针对IBDV的VP2基因设计两对特异性引物，针对经典毒株和超强毒株分别设计一对引物，用于鉴定IBDV和区分经典毒株和超强毒株，并进行相关特异性、重复性等实验。该方法具有较好的特异性和重复性，与禽类相关病毒、细菌不发生交叉反应，能够运用于临床上IBDV的快速检测，为传染性法氏囊病疫情的监测和控制提供了有效手段。