宝宝乐颗粒对幼鼠脾胃虚寒型非特异性功能性腹痛作用研究

石 菊，白 冰，许艳茹，伦宗慧，曲晓峰，边 雨，郑丽红，徐 建*

功能性胃肠病（FGIDs）［1］，又称肠脑互动异常，是一组因动力紊乱、内脏高敏感、黏膜免疫功能改变、肠道菌群改变、中枢神经系统处理功能异常［2］等因素引起的以腹痛、恶心呕吐、腹泻便秘、难以排出食物或粪便为特征的非器质性消化道紊乱性疾病.根据2016年发表儿童功能性胃肠病罗马Ⅳ标准，FAP-NOS的患儿经常有非特异性的胃肠道外躯体症状，应特别关注的是自主神经症状.目前研究认为，FAP-NOS可能是一种中枢性疼痛，由于多种因素影响了中枢神经对正常肠道功能的生理调控，导致正常的内调节信号在中枢神经系统放大，产生异常感觉，从而导致腹痛等症状.宝宝乐颗粒由白芍、黄芪、大枣、桂枝、干姜、山楂、六神曲、麦芽等八味药材组成.温中补虚，和里缓急，开胃消食，用于脾胃虚寒，脘腹隐痛，喜温喜按，胃纳不香，食少便溏.供试品口服，一次5～10g，一日2～3次，故6～9岁儿童临床最大使用剂量为30g/人/日，按70kg人和60g幼鼠等效剂量折算系数法可得幼鼠等效剂量为9.3g生药/kg/d.幼鼠按临床等效剂量1倍（A）、2倍（B）、4倍（C）设计3个剂量，即是10.0g生药/kg/d、20.0g生药/kg/d、40.0g生药/kg/d.

1 实验材料

1.1 实验动物

Wistar幼鼠70只，SPF级，体重180～220g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司［合格证号：SCXK（吉）2016-0003］.

1.2 实验药品与试剂

宝宝乐颗粒［修正药业集团股份有限公司，5g/袋］；P物质、5-羟色胺、肿瘤坏死因子α试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；乙醚（国药集团化学试剂有限公司）；石蜡油（天津市华东试剂厂）.

2 实验方法

2.1 造模方法

参照《中医实验动物学》和文献报道［3］的综合造模方法加以改进，具体如下：Wistar幼鼠70只，空白对照组10只，每天喂养维持饲料，自由饮水，其余幼鼠进行造模.造模过程分为两大阶段（均自由饮水）.第一阶段为前6天，单日喂精炼猪脂2mL/200g，双日喂饲甘蓝l0g/200g；每日38℃温水中游泳至疲劳；第二阶段为7～21天，每日再加灌100%番泻叶水浸液2mL/200g.

2.2 分组及给药剂量

将造模成功的Wistar幼鼠50只，随机分为5组，分为模型组、阳性药物对照组（黄芪建中丸组）、宝宝乐颗粒低、中、高剂量组（10g生药/kg/d、20g生药/kg/d、40g生药/kg），每组10只.从实验第22d开始，空白对照组、模型组均给予等量纯化水，给药体积为10mL/kg/d，持续给药14d.

2.3 检测指标

（1）一般情况.在实验过程中，观察幼鼠外观及活动情况，如精神萎靡、蜷卧、扎堆、反应迟钝、皮毛枯槁散乱、肛周污浊、饮食减少，消瘦等表现.记录给药前、后摄食量和体重变化.

（2）内脏敏感性检测［4］.检测前24h禁食、不禁水.乙醚麻醉后，将用石蜡油润滑的8F导尿管经肛门插入，气囊末端距肛门1cm，将导尿管固定于大鼠尾部.大鼠苏醒后，将其放在特制的塑料笼内，大鼠只能上下运动，无法前后活动和转身.30min适应期后通过观察不同的压力（20mmHg、30mmHg、40mmHg）条件下的结直肠扩张刺激下的AWR评分，用来反映幼鼠内脏敏感性的变化.结直肠扩张（Colorectal Distention，CRD）刺激时，每个CRD压力持续时间为20s，并且重复3次，最后取三次所测得的AWR评分的平均值，作为该扩张压力下最终的腹壁回撤反射（AWR）得分［5］.

评分标准：0分，大鼠对结直肠扩张无行为学反应；1分，结直肠扩张时身体静止不动，头部运动减少或抬高；2分，结直肠扩张时腹肌收缩，但腹部未抬离桌面；3分，结直肠扩张时腹肌收缩且腹部抬离桌面，嘶叫；4分，结直肠扩张时骨盆抬起，身体呈弓形.

（3）血中致痛物质P物质（SP）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、神经递质5-羟色胺（5-HT）含量的测定严格按规定程序进行，取静脉血3mL，注入含30uL 0.5M EDTA-Na2和抑肽酶1500KIU抗凝试管中混匀，离心，取血浆放-20℃保存备用，待测血浆中致痛物质P物质（SP）、神经递质5-羟色胺（5-HT）含量；常规静脉取血，分离血清，置-20℃保存备用，测定TNF-α水平.

2.4 统计分析

实验数据用Excel统计分析，数据采用t检验，结果用均值±标准差表示，p＜0.05具有统计学差异.

3 实验结果

3.1 一般情况

造模开始前，幼鼠皮毛洁白有光泽，精神状态良好.造模后，精神萎靡、眯眼、蜷卧、反应迟钝、行走不稳、皮毛枯槁散乱、肛周污浊、饮食减少，消瘦等表现.各组给药前后动物体重及摄食量变化未见明显差异.详见表1～2.

3.2 内脏敏感性评价

结果表明，模型组幼鼠在各个CRD压力（20mmHg、30mmHg和40mmHg）刺激下的AWR评分与空白对照组比较明显升高（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）；宝宝乐颗粒低、中、高剂量可降低幼鼠在CRD压力为20mmHg、30mmHg和40mmHg时的AWR评分，与模型组相比，差异具有统计学意义（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）.详见表3.

3.3 对血中致痛物质P（SP）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、神经递质5-羟色胺（5-HT）含量的影响

结果表明，与空白对照组比较，模型组幼鼠血浆中SP、5-HT和血清中TNF-α含量明显升高（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）；宝宝乐颗粒低、中、高剂量组幼鼠血浆中SP和5-HT含量降低，与模型组相比，差异具有统计学意义（p＜0.05，p＜0.01）；宝宝乐颗粒高剂量组幼鼠血清中TNF-α含量降低，与模型组相比，差异具有统计学意义（p＜0.05）.详见表4.

4 讨论

脾胃虚寒型功能性腹痛（FAP-NOS）发病机制尚未完全阐明，但脑-肠轴功能失调被公认为是其主要的发病机制之一.多种神经递质的分泌异常影响胃肠道运动、感觉和分泌功能.实验证实［6］，结直肠扩张刺激活化大脑多个区域一级边缘神经系统并对压力呈依赖性，使中枢性感觉高度敏感，加上后续反应引起胃肠功能失调.本研究结果表明，宝宝乐颗粒低、中、高剂量可降低幼鼠在CRD压力为20mmHg、30mmHg和40mmHg时的AWR评分，降低胃肠道内脏敏感性，使得大部分的胃肠道平滑肌运动増强.SP作为重要的痛觉兴奋性传导递质之一［7-8］，主要通过向上传递至中枢神经系统，也可逆向释放入损伤局部组织中，启动神经源性双向可逆炎症反应［9］，调节多种细胞产生各种细胞因子.Ansel［10］证实SP能促进肥大细胞释放炎症介质，刺激单核-巨噬细胞系统产生TNF-α；同时TNF-α还能刺激神经生长因子的合成和促进SP的释放［11］.5-HT可作为重要的神经递质，参与调节脑-肠轴的互动过程［12-13］，临床研究发现功能性腹痛患者5-HT的合成、释放和再摄取异常，可导致肠道感觉过敏和动力异常.本研究发现，脾胃虚寒型FAP-NOS模型鼠血浆5-HT水平明显升高，这与国外Simon等［14］发现功能性腹痛患者血中5-HT含量升高的结果一致.本研究结果表明，宝宝乐颗粒可以调节神经递质5-HT和SP的兴奋性，降低致痛物质SP的释放，刺激胆碱能神经元，其药理作用呈量效关系.宝宝乐颗粒在其温胃化湿行气的基础上佐以少量滋阴性寒的干姜，温而不燥，从而达到调节脑-肠轴功能，从根本上解决改善机体虚寒证候［15］.

表1 幼鼠给药前后体重变化表（s，n=10）

表2 对幼鼠摄食量的影响（s，n=10）

表3 各组幼鼠在不同扩张容量下AWR评分比较（s，n=10）

表4 对脾胃虚寒型幼鼠血浆中SP、5-HT和血清中TNF-α含量的影响（s，n=10）