Entinostat影响NK细胞对非小细胞肺癌杀伤作用的体外研究*

孙英慧 谢晓冬 欧阳明玥 宋爽 杨冀 于卉影

肺癌是最常见的恶性肿瘤，中国国家癌症中心发布的数据显示，肺癌发病率（0.57‰）和死亡率（0.46‰）均居国内恶性肿瘤首位［1-2］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌患者的80%～85%，多数患者确诊时已发展至晚期，5年生存率不足15%［3-4］。

组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）是一类对染色体结构修饰、基因表达调控具有重要作用的蛋白酶，其异常活动与肿瘤发生有关［5-6］。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACi）能够抑制HDAC的活性，抑制癌细胞增殖，促进凋亡［7］。Rohner等［8］和Kato等［9］研究表明HDACi（Trichostatin A）能够上调急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病中NKG2D（natural-killer group 2，member D）配体的表达，进而增强了白血病细胞对表达NKG2D的免疫细胞介导的杀伤敏感性。目前，已有多种HDACi被美国食品及药物管理局（FDA）批准上市或正在进行抗肿瘤的临床试验，其中Entinostat对NSCLC的治疗正在进行临床Ⅱ期研究［10］。Entinostat可强烈抑制HDAC1和HDAC3的活性，并能显著抑制NSCLC、肝癌和乳腺癌等细胞的增殖，同时上调主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达［11-14］。本实验拟研究Entinostat对NSCLC细胞A549和HCC-827细胞表面NKG2D配体表达的影响，以及配体表达的变化是否会影响肿瘤细胞对免疫细胞杀伤作用的敏感性，进而为Entinostat治疗NSCLC提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和外周静脉血标本 NSCLC 细胞HCC-827购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，A549 为本实验室保存。用于NK 细胞制备的外周静脉血采自签署知情同意书的健康志愿者，研究得到本院伦理委员会的审查和批准。

1.1.2 试剂和耗材 荧光素标记的抗体（MICA-PE、MICB-APC、ULBP2/5/6-PE）、相应同型对照抗体购自美国BD公司。Entinostat购自美国Selleck公司。噻唑蓝（MTT）购自爱必信（上海）生物科技有限公司、DMSO购自美国Sigma公司。人MICA酶联免疫吸附实验试剂盒购自美国Abcam公司。RNeasy总RNA纯化mini试剂盒、Quanti Tect®反转录试剂盒、Quanti NovaTMSYBR®Green染料法PCR试剂盒均购自德国QIAGEN公司。CytoTox®96非放射性细胞毒性检测试剂盒购自美国Promega公司。DMEM/F-12培养基和RPMI 1640培养基购自上海源培生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549 和HCC-827 细胞分别用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基和10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。细胞处于80%融合时进行传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 NK细胞制备 采取健康成年人外周静脉血10 mL，Ficoll离心分离，制备外周血单个核细胞（PBMCs），计数后参照文献方法培养NK细胞［15］。培养14 d后检测NK细胞表型，并收集NK细胞用于杀伤实验。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的细胞以4×103个/孔的密度接种于96孔板，贴壁后，以不同浓度Entinostat处理A549和HCC-827细胞24、48、72 h。然后向每孔中加入10%体积的MTT（5 mg/mL），避光孵育4 h，弃掉上层培养基后，每孔加100 μL DMSO，避光低速震荡10 min，用酶标仪检测492 nm波长处的吸光值（OD值），计算Entinostat对细胞增殖的抑制率及IC50。根据下列公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率（%）=［1-（实验组OD 值-调零组OD值）/（对照组OD值-调零组OD值）］×100%

1.2.4 流式细胞术检测细胞表面配体表达 收集0.25、0.5、1 μmol/L Entinostat 处理48 h 后的细胞，取2×105个细胞分别加入抗MICA 抗体、抗MICB 抗体、抗ULBP-2/5/6 抗体及相应同型对照抗体，避光孵育30 min，PBS 洗涤两次后使用美国BD 公司的FACS Canto®Ⅱ流式细胞仪进行检测。

1.2.5 ELISA 检测可溶性MICA（soluble MICA，sMICA）水平 收集0.25、0.5、1 μmol/L Entinostat处理48 h后的细胞培养基，3 000 r/min，离心10 min，留取上清，按ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.2.6 RT-PCR检测基因表达 收集0.25、0.5、1 μmol/L Entinostat 处理48 h 后的细胞，取2×106个细胞，使用RNeasy总RNA纯化mini试剂盒提取RNA，使用Quanti Tect®Reverse Transcription Kit将RNA反转录成cDNA，以GAPDH作为内参，使用Quanti NovaTMSYBR®Green染料法PCR试剂盒对样本进行染色，具体操作步骤按上述试剂盒说明书进行。使用引物序列如下：

MICA-For 5'-AAGACCAAGACACTCTATCACG C-3'；MICA-Rev 5'-GGTGTCGTGGCTCAAAGATAC-3'；MICB-For 5'-CTGATGGGAATGGAACCTACC-3'；MICB-Rev 5'-GTCTGTCCGTTGACTCTGAAGC-3'

1.2.7 细胞毒性检测 以0.25、0.5、1 μmol/L Entinostat 处理48 h 的A549 和HCC-827 细胞作为靶 细胞，NK 细胞作为效应细胞，效靶细胞比（effector-to-target，E：T）为20：1，采用乳酸脱氢酶释放实验检测NK细胞对A549和HCC-827细胞的杀伤率，操作步骤按CytoTox®96 非放射性细胞毒性检测试剂盒使用说明书进行。根据下列公式计算细胞毒性百分率。

细胞毒性百分率=（A实验孔-A靶细胞自然释放孔-A 效应细胞自然释放孔）/（A 靶细胞最大释放孔-A靶细胞自然释放孔）×100%。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分学析。每组实验独立重复3次，计量资料以表示，不同数据组间的比较采用单因素方差分析检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Entinostat 对A549 和HCC-827 细胞的增殖抑制作用

不同浓度的Entinostat处理细胞24、48、72 h后，药物能够抑制细胞增殖，且具有时间-剂量依赖性（图1）。Entinostat处理A549细胞24、48、72h的IC50分别为（40.78±2.08）μmol/L、（4.38±0.40）μmol/L和（2.74±0.11）μmol/L；处理HCC-827细胞24、48、72 h的IC50分别为（39.79±4.01）μmol/L、（2.40±0.25）μmol/L和（0.4±0.03）μmol/L。故此后续实验采用＜2 μmol/L（即0.25、0.5、1 μmol/L）Entinostat及48 h作为实验浓度和处理时间。

2.2 Entinostat对A549和HCC-827细胞表面NKG2D配体表达的影响

以0.25、0.5、1 μmol/L Entinostat 分别处理A549和HCC-827 细胞48 h，流式细胞术检测细胞表面NKG2D 配体的表达。A549 细胞1 μmol/L Entinostat处理组MICA 的平均荧光强度（mean fluoyescence intensity，MFI）值为（615.67±265.68），与对照组MFI 值（165.67±87.8）相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；0.5、1 μmol/L Entinostat 处理组ULBP-2/5/6 的MFI 值分别为（448.67±17.62）和（729.67±149.60），与对照组MFI 值（212.33±40.01）相比差异具有显著性（P＜0.05）；但各Entinostat 处理组MICB 的MFI 值与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05，图2）。

HCC-827细胞，0.5、1 μmol/L Entinostat处理组MICA的MFI值分别为（293.67±47.52）和（323.67±63.52），与对照组MFI值（203.33±16.86）相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；0.5、1 μmol/L Entinostat处理组MICB的MFI值分别为（79.33±18.48）和（81.33±9.24），与对照组MFI值（41.00±12.73）相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；0.25、0.5、1 μmol/L Entinostat处理组ULBP-2/5/6的MFI值分别为（282.00±44.81）、（452.00±90.10）和（857.50±196.23），与对照组MFI值（150.50±15.29）相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图1 不同浓度Entinostat对A549和HCC-827细胞增殖的影响

图2 不同浓度Entinostat对A549细胞表面NKG2D配体表达的影响，**P＜0.01，***P＜0.001

图3 不同浓度Entinostat对HCC-827细胞表面NKG2D配体表达的影响，*P＜0.05，**P＜0.01

2.3 Entinostat 对A549 和HCC-827 细胞培养上清中sMICA水平的影响

肿瘤细胞表面配体MICA 可能脱落形成sMICA，sMICA的表达可能是肿瘤细胞发生免疫逃逸的原因之一［16-17］。因此，本研究又检测了细胞培养上清中sMICA的水平。结果发现，1 μmol/L Entinostat处理A549细胞48 h后，sMICA的水平为（82.54±13.34）pg/mL，与对照组（60.57±11.66）pg/mL相比，1 μmol/L Entinostat能显著上调A549细胞培养上清中sMICA的水平（P＜0.05）。但是Entinostat对HCC-827细胞培养上清中sMICA水平的影响并不显著（P＞0.05，图4）。

图4 不同浓度Entinostat对A549和HCC-827细胞培养上清中sMICA水平的影响

2.4 Entinostat对A549和HCC-827细胞NKG2D配体基因表达的影响

RT-PCR结果显示，0.5、1 μmol/L Entinostat能显著上调A549细胞MICA基因表达水平，分别是对照组的（5.04±0.22）倍和（8.72±2.06）倍；1 μmol/L Entinostat能显著上调MICB基因表达水平，是对照组的（7.90±0.66）倍。0.5、1 μmol/L Entinostat能显著上调HCC-827细胞MICA基因表达水平，分别是对照组的（3.60±1.08）倍和（7.06±0.98）倍；MICB 基因表达水平分别是对照组的（6.33±4.50）倍和（9.40±2.90）倍（图5）。

2.5 Entinostat 诱导A549 和HCC-827 细胞表面配体上调对NK细胞杀伤敏感性的影响

通过研究发现，Entinostat能诱导A549和HCC-827细胞表面活化性配体MICA、MICB和ULBP-2/5/6表达的上调，为了检测配体的上调是否影响NK细胞的杀伤活性，本研究以0.25、0.5、1 μmol/L Entinostat处理48h的A549和HCC-827细胞作为靶细胞，NK细胞作为效应细胞，效靶细胞比为20：1，进行了乳酸脱氢酶释放实验。结果发现，NK细胞对0.25、0.5、1 μmol/L Entinostat处理组A549细胞的杀伤率分别为（23.25±5.02）%、（19.55±6.58）%和（11.75±0.5）%，与对照组（15.45±0.49）%相比均无显著性差异（P＞0.05）。NK细胞对0.25、0.5、1 μmol/L Entinostat 处理组HCC-827 细胞的杀伤率分别为（15.00±1.27）%、（22.35±8.84）%和（25.90±12.59）%，与对照组（7.35±1.77）%相比，0.5、1 μmol/L Entinostat能显著提高HCC-827对NK细胞杀伤作用的敏感性（P＜0.05，图6）。

图5 不同浓度Entinostat对A549和HCC-827细胞MICA、MICB基因表达的影响，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

图6 NK细胞对Entinostat诱导后的A549和HCC-827细胞的杀伤活性，*P＜0.05

3 讨论

全球范围内，NSCLC 的发病率和死亡率均占恶性肿瘤的首位［1］，多数患者发现时已经发展为晚期，手术切除已不是最佳的治疗方案，而化疗的毒性反应较多，严重影响患者的生存质量，因此，靶向药物的出现为患者带来曙光。根据美国临床试验数据库数据显示，目前有多项Entinostat 治疗NSCLC 的临床试验正在开展。

研究表明Entinostat 能够上调骨肉瘤NKG2D 配体的表达，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用［5］。还有研究者在白血病细胞上也得到了类似的结果［8-9］。本研究中，根据MTT 检测结果，采用0.25，0.5、1μmol/L 的Entinostat 诱导A549和HCC-827细胞48h。流式细胞术和RT-PCR 结果显示，1μmol/L 的Entinostat 能够显著上调A549 细胞表面NKG2D 配体（MICA和ULBP-2/5/6）的表达，提高MICA和MICB基因的表达水平。0.5、1μmol/L 的Entinostat 能显著上调HCC-827 细胞表面NKG2D 配体（MICA、MICB 和ULBP-2/5/6）的表达，并提高MICA和MICB基因的表达水平。MICA、MICB 和ULBP-2/5/6 属于活化性配体，能够与NK 细胞表面相应的受体结合，激活免疫细胞，杀伤肿瘤细胞［18-20］。NKG2D 受体和配体相互作用所介导的免疫细胞杀伤作用被认为在抗肿瘤活动中具有重要作用［21］。因此，采用乳酸脱氢酶释放实验检测了不同浓度Entinostat 诱导A549 和HCC-827细胞48h后，NK细胞对其的杀伤作用。结果发现0.5、1μmol/L 的Entinostat 显 著 提 高 了NK 细 胞 对HCC-827细胞的杀伤作用，而Entinostat未提高NK细胞对A549 细胞的杀伤作用。有研究表明，MIC 分子的脱落是肿瘤细胞免疫逃逸的机制，MICA/B 分子的脱落可能诱导了抗肿瘤免疫效应细胞功能的下调［22-24］。MICA/B可以被去整合素-金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM）切割，sMICA 能够诱导CD8+T 细胞和NK 细胞上NKG2D 受体的内在化和溶酶体降解，从而下调抗肿瘤免疫细胞的功能［25］。已有研究证实HDAC 抑制剂丙戊酸（Valproic acid）能下调参与产生sMICA/B 的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的活性［26］。本研究结果显示，1μmol/L 的Entinostat 上调了A549 细胞培养上清中sMICA 含量，推测这可能是Entinostat 未能提高NK细胞对A549细胞杀伤作用的原因。由于NK细胞的杀伤功能受多种活化性和抑制性受体-配体信号的动态调节，而本研究只检测了NKG2D 活化性配体，可能还有其他活化性或抑制性受体配体的表达受到调节，这也可能是造成A549 细胞对NK 细胞杀伤作用不敏感的原因，具体机制还有待进一步研究。

如何上调活化性配体的表达，并抑制活化性配体的脱落，抑制肿瘤免疫逃逸是一个研究焦点。本研究中，Entinostat 上调了HCC-827细胞表面NKG2D配体的表达，并提高了NK细胞对HCC-827细胞的杀伤作用，虽然未增强A549 细胞对NK 细胞杀伤作用的敏感性，但这也为Entinostat 治疗NSCLC 提供了新的理论依据。