乳液静电喷雾制备普鲁兰多糖纳米颗粒

(1.浙江工业大学 海洋学院，浙江 杭州 310014；2.杭州食品药品检验研究院，浙江 杭州 310014)

近年来，营养保健食品被视为一种较为直接的营养来源。研究发现：营养保健品在预防疾病方面的有效性取决于对保持活性成分的生物利用度[1]。β-胡萝卜素是一种常见的抗氧化剂，但是由于其性质不稳定以及生物利用度低等缺陷，在食品工业中的应用受到了限制。为解决这一问题，有学者提出可以利用不同的包埋方法包封β-胡萝卜素以提高其生物利用率[2]。目前包封活性物质的方法主要有喷雾干燥、喷雾流化床干燥和静电喷雾干燥等。喷雾干燥法容易使热稳定性差的物质发生热降解，从而影响其生物利用率及包埋率[3]；喷雾流化床干燥法制备的颗粒尺寸较大，雾化喷枪易堵塞[4]；相比之下，静电喷雾干燥法易于控制，作用条件温和，能够有效减少生物活性物质的变性[5]。目前已有成功采用静电喷雾技术包封生物活性成分的先例[6]，但是这些研究都没有系统地考察乳化剂对颗粒的影响。普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵产生的胞外水溶性黏质非离子多糖，与其他多糖相比，该糖具有规则的线性结构，该结构使其溶解度较大且结构弹性较大[7]。普鲁兰多糖水溶液具有较高的链缠结浓度，在静电喷雾过程中可以形成较为稳定的射流，从而得到较为均一的微纳米颗粒。笔者采用3种常见的可用作乳化剂的蛋白质结合普鲁兰多糖，制备普鲁兰多糖-蛋白质乳液来包封β-胡萝卜素，利用超声乳化技术增加蛋白质与普鲁兰多糖的结合。通过对乳化体系的稳定性及电喷雾颗粒的尺寸及包封效果进行了考察，研究了不同种类蛋白质作为乳化剂制备的乳液对静电喷雾颗粒的影响，探讨了采用普鲁兰多糖结合蛋白质包封β-胡萝卜素的可行性，为后续不同包封体系的制备提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白，源叶生物有限公司(上海)；乳清蛋白，源叶生物有限公司(上海)；酪蛋白酸钠，阿拉丁试剂；普鲁兰多糖，阿拉丁试剂；中链甘油三酯(MCT)，博星化工有限公司(武汉)；β-胡萝卜素(HPLC 90%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TEADFS-103-21电纺丝设备，北京新锐佰纳科技有限公司；磁力搅拌器、高速剪切机，德国艾卡仪器有限公司；FS-2000T超声波处理，生析超声仪器公司；MCR52流变仪，英国马尔文仪器有限公司；DDSJ-308A电导率测定仪，雷滋仪电科学仪器股份有限公司；动态光散射粒径及zata电位分析仪DLS，美国布鲁克海文仪器公司；AVATAR370傅里叶变换红外光谱仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Q20差示扫描量热仪，美国TA仪器；VEGA 3 SBH台式钨灯丝扫描电镜，泰思肯贸易(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乳液的制备

实验方法参考文献[8]并稍作改动。步骤为

1) 称取12 g普鲁兰多糖，用磁力搅拌器恒速搅拌，制备质量浓度为8%的普鲁兰多糖水溶液。

2) 分别取0.1 g的乳清蛋白、大豆分离蛋白和酪蛋白酸钠，加入到10 mL均匀的普鲁兰多糖水溶液中，振荡搅拌，使蛋白质溶解并均匀分散于普鲁兰多糖水溶液中，制备水相。

3) 取0.01 gβ-胡萝卜素，溶于中链甘油三酯中，制备质量浓度为0.1%的β-胡萝卜素的油相。

4) 在水相中加入油相，制备油相质量分数为10%的乳液。

5) 乳液在12 560 r/min转速下预乳化3 min后超声处理，超声功率为600 W。

设置未超声处理的乳液为对照组，所制备的乳液均在室温下储藏。

1.3.2 粒径分析

采用动态光散射粒径及zata电位分析(DLS)测定乳液粒度。将测乳液稀释至蛋白质质量浓度为0.001 mg/mL，进行粒度测定，实验在室温下进行3次，取平均值。

1.3.3 电导率测定

乳液的电导率对静电喷雾产生一定影响，采用电导率测定仪(DDSJ-308A)在室温下测定乳液电导率，测量3次，取平均值。

1.3.4 纳米颗粒制备及静电喷雾工艺

纳米颗粒制备及静电喷雾工艺为

1) 使用铝箔覆盖接收器接收制备的颗粒，调节喷射针头与接收器之间的距离为20 cm。

2) 喷射过程采用注射泵驱动，控制乳液流速为0.36 mL/h，静电纺丝设备电压调节为8～10 kV进行颗粒制备。

3) 将附着在锡箔纸上的产品取下进行后续颗粒表征测试。

1.3.5 电子扫描显微镜(SEM)表征

通过台式电镜扫描仪(捷克TESCAN VEGA 3 SBH)观察封装结构的形态。在扫描电镜成像之前，取小块静电喷雾产品粘在导电胶上，经过喷金处理后放入SEM电镜试验仓进行测试。检测时工作电压为15 kV，工作距离为8 mm，放大倍数为8 000，纤维直径分布和平均值采用Image-Pro Plus计算。

1.3.6 傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)表征

使用FT-IR测量粉末状乳清蛋白、酪蛋白、大豆分离蛋白、普鲁兰多糖和β-胡萝卜素。取少量样品分散在光谱级溴化钾中充分研磨，混合均匀，压片，测试。将静电喷雾制备的固体产品剪裁成适当大小，采用ATR-FTIR进行红外光谱测试。在波数4 000～600 cm-1和光谱分辨率为4 cm-1的平均红外区域进行光谱分析。

1.3.7 差式扫描量热法(DSC)表征

差式扫描量热法以样品吸热或放热的速度，即热流率为纵坐标，以温度或时间为横坐标，测试制备的颗粒的热性能。差式扫描量热仪在20～240 ℃，升温速率5 K/min，氮气条件下进行评价[9]。

1.3.8 统计分析

统计分析使用Origin 9.1进行，使用单因素方差分析(ANOVA)测定所有报告的统计学差异，p<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳液粒径及电导率分析

通过乳液的动态光散射粒径测量可以发现：经过超声处理后乳液液滴的尺寸和多分散指数均显著降低，这可能是因为超声波的机械振动和空化作用的作用力使乳液液滴在剧烈震动下破裂[10]，进而形成较为均一且粒径较小的液滴。超声处理的乳液多分散指数(PDI)比未超声处理的乳液要小，表明纳米乳液的粒径分布更窄。表1列出了未采用超声乳化和经过超声乳化处理的以酪蛋白(SC)、大豆分离蛋白(SPI)和乳清蛋白(WP)为乳化剂的乳液及电喷雾颗粒的粒径和不同的乳液电导率数值。

表1 乳液物理表征1)Table 1 Physical characterization of emulsion

注：1) 不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

乳液电导率关系到静电喷雾能否成功，超声乳化的乳液与未超声乳化的乳液相比，电导率呈现明显增加的趋势，说明超声波对乳液系统的高强度破碎作用对乳液电导率有影响。有研究发现：使用高强度超声波处理乳清蛋白、大豆分离蛋白和酪蛋白溶液均未引起电导率的显著变化[11]。因此在本次研究中经过超声乳化的乳液电导率均有所下降，可能是样品中含有的普鲁兰多糖引起的。多糖在超声波中具有极高的运动加速度，会产生激烈的变化，这种快速变化的机械运动会引起多糖这类生物大分子主链中一些化学键断裂但不会使多糖化学性质完全改变[12]。

2.2 电子扫描显微镜(SEM)表征

乳液的性质不仅对乳液静电喷雾能力有影响，对静电喷雾制备的颗粒结构也有重要影响。图1显示了不同乳液静电喷雾后获得的颗粒结构的SEM图像，从图1中可以看出：不同的乳化方法制备得到的颗粒形态不同，未经过超声乳化的乳液静电喷雾颗粒得到球形微米级颗粒结构，经过超声乳化的乳液静电喷雾得到球形的亚微米颗粒结构，且颗粒形状更为均一。这一现象可由未超声乳化处理的乳液液滴具有较大的平均直径作为解释，另一方面当蛋白质的量不足以完全覆盖油滴表面时油滴表面上吸附的蛋白质分子团会迁移到空气-水界面导致乳液内部油滴聚结增大液滴密度，从而影响颗粒的粒径尺寸[13]。

乳液液滴原有液滴尺寸会对电喷雾颗粒尺寸产生影响，对乳液颗粒的电镜扫描图分析得到乳液电喷雾颗粒平均粒径，见表1，乳液电喷雾颗粒粒径分布，见图2。由于大豆分离蛋白表面的疏水基团较少，使大豆分离蛋白更容易与油包水颗粒发生聚集、沉降，无法与结合脂溶性活性物质的液滴形成稳定的颗粒[14]，造成乳液粒径较大。

2.3 傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)分析

FT-IR光谱用来考察颗粒中各物质化学结构，以及蛋白质和普鲁兰多糖之间可能存在的相互作用。图3分别显示了电喷雾颗粒的红外光谱和酪蛋白酸钠、大豆分离蛋白、乳清蛋白和普鲁兰多糖的红外光谱。在1 600～1 700 cm-1处和1 510～1 530 cm-1处出现的峰值是蛋白质的主要特征峰，β-胡萝卜素中反式共轭双键的伸缩振动在964 cm-1处有最强吸收峰；在未超声处理的乳液中1 600～1 700 cm-1处和1 510～1 530 cm-1处出现的峰值没有发生明显位移，说明在未超声处理的乳液中蛋白质与普鲁兰多糖没有发生化学键合；静电喷雾颗粒与原料粉末的红外峰基本一致，说明在静电喷雾过程中不造成分子结构的改变[15]。通过电喷雾颗粒在964 cm-1的特征吸收峰的情况可以判断：β-胡萝卜素在颗粒中的包封情况，无论是何种乳化方法，在大豆分离蛋白、酪蛋白、乳清蛋白与普鲁兰多糖形成的封装结构中，β-胡萝卜素的特征吸收峰都发生了改变，该变化说明β-胡萝卜素与蛋白质发生了氢键相互作用，对蛋白质构象产生影响，导致吸收峰发生位移。

2.4 纳米颗粒热学性能(DSC)分析

图4为不同样品未经过超声处理和超声处理制备的乳液的DSC曲线。DSC曲线显示：所有的样品在60 ℃和80 ℃附近都有一个平缓的吸收峰，可能是某些被蒸发或融化的杂质产生的微弱吸收峰;超声乳化处理的大豆分离蛋白乳液在吸热峰前出现两个较小的放热峰，110 ℃附近出现的放热峰可能是由部分样品先熔融后冷却结晶导致；胡萝卜素在高于103 ℃的温度下会发生蒸发降解现象，推测在110 ℃附近出现的吸收峰是由β-胡萝卜素氧化导致。超声乳化处理的乳液DSC曲线中110 ℃附近的吸收峰面积比高速剪切乳化的乳液大，由此得到超声乳化处理的乳液中β-胡萝卜素与普鲁兰多糖/蛋白质结合的氢键更多，说明超声乳化处理的乳液静电喷雾颗粒中β-胡萝卜素的负载量更多，也即超声乳化对于增加生物活性成分的包封效率有积极的作用。

图2 乳液电喷雾颗粒尺寸分布Fig.2 Size distribution of emulsion electrospraying particles

1—UH大豆分离蛋白；2—US乳清蛋白；3—US大豆分离蛋白；4—UH乳清蛋白；5—US酪蛋白；6—UH酪蛋白

1—大豆分离蛋白；2—普鲁兰多糖；3—乳清蛋白；4—酪蛋白；5—β-胡萝卜素

1—大豆分离蛋白/普鲁兰多糖颗粒;2—酪蛋白/普鲁兰多糖颗粒;3—乳清蛋白/普鲁兰多糖颗粒图4 乳液的DSC曲线Fig.4 DSC curve of emulsion

3 结 论

笔者采用超声方法制备乳液后通过乳液静电喷雾技术制备颗粒，并对颗粒进行表征，测量了所有乳液颗粒尺寸和电导率等物理性质以及静电喷雾颗粒尺寸及分布、质构等指标，发现超声乳化的乳液粒径更小且分布更为均匀。通过傅里叶红外光谱分析发现：蛋白质与普鲁兰多糖没有发生化学键合，蛋白质与多糖结合对于它们各自的构象并未产生影响，但是超声乳化对于增加生物活性成分的包封效率有积极的作用。实验数据为后续进一步深入研究提供了理论基础。