磷酸吡哆醛依赖型天冬氨酸α-脱羧酶的研究

(江南大学生物工程学院，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室 江苏 无锡 214122)

β-丙氨酸是一种典型的非蛋白氨基酸，具有重要的生理作用，是泛酸、辅酶A以及酰基载体蛋白的重要前体[1]。同时，β-丙氨酸作为一种重要的平台化合物，也是合成含氮化合物(例如丙烯酰胺和丙烯腈)的重要前体，在生物制药和生物炼制等领域有着广泛的应用[2-3]。目前，β-丙氨酸的合成主要采用化学合成法[4]，该方法存在着污染大、能耗大和后处理困难等缺陷。近年来，生物法合成β-丙氨酸受到人们的关注，尤其是对利用L-天冬氨酸α-脱羧酶(ADC)催化转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究增多。ADC基因存在于大多数细菌、动物及一些古细菌中。目前，对利用细菌ADC(多被命名为PanD)催化转化获得β-丙氨酸的研究已有大量报道，主要为来源于大肠杆菌[2]、谷氨酸棒杆菌[5-6]、枯草芽孢杆菌[4,7]的重组酶。尽管基因来源和转化策略不同，细菌PanD与底物反应时都存在基于机理的失活作用，这是其应用的主要瓶颈。这一失活作用的机理是细菌PanD以丙酮酰基团作为辅基，脱羧过程中根据质子化位点的不同，存在两种途径，一种能顺利完成正常的催化脱羧过程，另一种是转氨反应，会导致酶的不可逆失活[4,8]。底物失活作用使得这些酶在反应过程中的催化稳定性很低，难以开发成为理想的酶制剂。近年来，一些学者发现一些真核生物及古细菌中的谷氨酸脱羧酶(GAD)类似蛋白具有L-天冬氨酸α-脱羧酶的活性。这类酶都以磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶，专一性不高，目前还没有详细的酶学性质和在制备β-丙氨酸中的应用研究。真核生物中，在人类基因中发现GADL1具有天冬氨酸α-脱羧功能，在肌肉细胞和肝脏细胞中发现直接生成β-丙氨酸，用于合成肌肽[9]；在昆虫基因中需要由GAD2催化获得的β-丙氨酸来获得皮质硬化[10-13]；古细菌中也发现了具有ADC活性的酶，这类酶底物作用范围比较广，多被注释为酪氨酸脱羧酶(MfnA)[14-16]。关于古细菌的报道多为极端微生物，它们的酶大多表现为耐高温高盐，酶学性质较适合工业化生产。本研究旨在筛选磷酸吡哆醛依赖型ADC的基因来源，考察其在生物法合成β-丙氨酸上的应用潜力。从数据库中查找获得5种不同来源的基因序列，利用基因合成技术和基因工程手段，构建高效表达ADC的重组菌。首先通过实验发现来源于詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)的重组酶具有较高的酶活力，然后详细考察了该酶的最适温度、热稳定性、最适pH、pH稳定性、辅酶稳定性以及酶催化合成β-丙氨酸能力等，研究结果表明该酶在工业应用上有很高的潜力。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株与主要试剂

L-天冬氨酸、丙氨酸和磷酸吡哆醛购自Sigma公司；限制性内切酶和标准蛋白ladder购自Fermentas公司；T4 DNA连接酶和DNA Marker购自TaKaRa公司；卡那霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒小量提取试剂盒、纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自Axygen公司；1mL His-trap HP色谱柱购自美国GE公司，其他试剂为国产分析纯；用于克隆和表达的菌株为的E.coliBL21(DE3)，用于表达的质粒为pET28a(+)，均为实验室冻存。

1.2 目的基因的克隆与重组菌的构建

从NCBI数据库中查找获得ADC基因序列，按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化，在基因序列5’端引入酶切位点NdeI，3’端引入HindIII。优化后的序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成并连接至克隆载体pUC57-simple。提取质粒pUC57-panD，用NdeI和HindIII双酶切，连接至同样双酶切后的pET-28a(+)，T4连接酶连接过夜，获得表达载体pET28a-ADC并化转至E.coliBL21(DE3)，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-ADC，并保藏于-70 ℃甘油管中。

1.3 重组酶的表达与纯化

将重组菌从甘油管中接10 μL菌体至20 mL LB培养基(含有50 μg/mL卡那霉素)中，37 ℃，200 r/min培养过夜后，转接2 mL菌体至50 mL TB培养基(含有50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃培养2 h后加入25 μL 1 mol/L IPTG(终浓度为0.5 mol/L)，25 ℃ 200 r/min培养16 h。发酵结束后收集菌体，用50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)洗两遍后，加入缓冲液，振荡混匀，稀释OD至10后置于冰上，利用超声波破碎仪破碎细胞(破1 s停2 s，破碎时间5 min)，破碎液于4 ℃温度下12 000 r/min离心20 min，取上清保留。破碎液上清经His Trap-HP色谱柱纯化(方法参照Novagen his bind kits说明书)后获得纯酶，以Bradford法测定酶液浓度，并用SDS-PAGE检测纯度。

重组酶的酶活测定方法：将0.5 mg纯酶加入2.5 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)混合，70 ℃预热30 min后加入同样预热过的166 μL 200 g/L L-天冬氨酸(Na盐)(终浓度为100 mmol/L)，反应1 h，加入0.1 mL NaOH溶液(浓度为1 mol/L)灭活。样品以等体积丙酮20 ℃沉降2 h后用HPLC检测β-丙氨酸与L-天冬氨酸的浓度(邻苯二甲醛衍生法)，计算酶活。酶活(U)定义为在温度70 ℃，pH 8.0条件下，每分钟转化产生1 μmolβ-丙氨酸所需要的酶量为一个酶活单位(μmol/min)，比酶活为每mg蛋白产生的酶活(U/mg)。

1.4 重组酶酶学性质测定

1.4.1 重组酶最适温度和热稳定性的测定

将0.25 mg纯酶和250 μL 2.5 mmol/L PLP加入到2.5 mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 8.0)中，分别于37，60，70，75，80，85，90 ℃下预热30 min后加入166 μL 200 g/L L-天冬氨酸钠(终浓度为100 mmol/L)，反应20 min后加入0.1 mL NaOH溶液(浓度为1 mol/L)灭活。样品以等体积丙酮-20 ℃沉降2 h后用HPLC检测β-丙氨酸的浓度，计算酶活。将上述体系放置12 h后加入100 mmol/L L-天冬氨酸钠，反应条件、样品处理与酶活计算同方法1.3。

1.4.2 重组酶最适pH和pH稳定性的测定

分别将0.25 mg纯酶和250 μL 2.5 mmol/L PLP加入到2.5 mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 6.0～8.0)和Tris-HCl缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 8.0～10.0)中，再加入166 μL 200 g/L L-天冬氨酸钠(终浓度为100 mmol/L)，于80 ℃反应20 min后加入0.1 mL NaOH溶液(浓度为1 mol/L)灭活。样品处理与酶活计算同方法1.3。上述体系放置12 h后加入166 μL 200 g/L L-天冬氨酸钠(终浓度为100 mmol/L)，反应条件、样品处理与酶活计算同方法1.3。

1.5 辅酶PLP的稳定性实验

1.5.1 底物对辅酶PLP稳定性的影响

将830 μL不同浓度L-天冬氨酸钠溶液(终浓度分别为0，50，100，150，200，250，500 mmol/L)加入到1.67 mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 8.0，含有1 mmol/L的PLP)中，放置于80 ℃环境中，每30 min测一次反应液在390 nm处的吸光度。

1.5.2 温度对辅酶PLP稳定性的影响

将830 μL 200 g/L L-天冬氨酸钠溶液加入到1.67 mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 8.0，含有1 mmol/L的PLP)中，放置于30，37，50，60，70，80 ℃环境中，每30 min测一次反应液在390 nm处的吸光度。

1.5.3 pH对辅酶PLP稳定性的影响

将830 μL 200 g/L L-天冬氨酸钠溶液和100 μL 2.5 mmol/L PLP溶液分别加入到1.57 mL乙酸-乙酸钠缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 5.0～6.0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 7.0～8.0)和Tris-HCl缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 9.0～10.0)中，放置于80 ℃环境中，每30 min测一次反应液在390 nm处的吸光值。

1.6 重组酶的酶催化

1.6.1 底物浓度对酶催化的影响

反应体系为10 mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 8.0，PLP浓度为0.25 mmol/L)。将0.5 mg纯酶与底物质量浓度分别为0，5，20，50，80，100 g/L的L-天冬氨酸钠溶液分别60 ℃水浴反应2 h和12 h，测定生成的β-丙氨酸含量。样品处理与酶活计算同方法1.3。

1.6.2 酶催化实验

酶催化体系为10 mL，将2.5 mg纯酶用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(浓度为50 mmol/L，pH 8.0)补充至10 mL。先分别将0.5 mL不同浓度的PLP溶液(终浓度分别为0，0.25，0.5 mmol/L)加入到体系中混匀，60 ℃预热30 min。再加入1 mL 200 g/L L-天冬氨酸钠，60 ℃水浴反应，每隔2 h取一次样，样品处理及β-丙氨酸测定方法同1.3。

2 结果与讨论

2.1 基因克隆与序列分析

实验从NCBI文库中筛选获得5种以磷酸吡哆醛为辅酶且具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的序列，分别为Homosapiens(Gene ID:339896, GADL1)，Aedesaegypti(GeneID:5569335, GAD2)，ThermococcuskodakarensisKOD1(Gene ID:3234484, ADCT.k)，PyrococcushorikoshiiOT3(Gene ID:1443262, ADCP.h)和M.jannaschiiDSM 2661(Gene ID:1450889, ADCM.j)。磷酸吡哆醛依赖型ADC的蛋白序列与细菌PanD的蛋白序列同源性很低，但其中GADL1和GAD2与Homosapiens的谷氨酸脱羧酶的同源性为54.89%，ADCP.h与ADCM.j均被注释为酪氨酸脱羧酶(MfnA)，它们的同源性为38.75%。将这些序列经密码优化后利用基因合成技术获得，并置于pET-28a(+)的T7启动子下游，获得重组质粒pET28a-GADL1，pET28a-GAD2，pET28a-ADCT.k，pET28a-ADCP.h和pET28a-ADCM.j，同时重组酶N端均获得6个组氨酸标签。

2.2 重组酶的表达与纯化

2.1中重组质粒转化E.coliBL21(DE3)，通过IPTG低温诱导和超声破碎获得重组酶的高效表达，SDS-PAGE验证结果如图1所示。泳道1～4分别为ADCT.k，ADCP.h，GADL1和GAD2，5号泳道为蛋白Marker，6号泳道为ADCM.j；蛋白Marker为Page ruler low range unstained protein ladder(MW:3.4～100 kDa)，购自Fermentas公司。

图1 PLP依赖型重组酶的表达Fig.1 Expression of PLP-dependentL-aspartate -decarboxylase

重组酶经过His-Trap HP纯化后获得纯酶,SDS-PAGE验证结果如图2。泳道1～5分别为ADCT.k，ADCP.h，GADL1，GAD2和ADCM.j；蛋白Marker(泳道6)为小分子量蛋白标准样品(MW:3.4～100 kDa)购自Fermentas公司。来源于Homosapiens和Aedesaegypti的重组酶产生了大量的包涵体，没有获得其功能性表达。来源于古细菌的ADCT.k，ADCP.h和ADCM.j均获得有效表达，电泳图利用Image LabTM软件(美国Bio-Rad公司)分析获得其表达量分别为72%，53%和80%。经过His-Trap HP柱子纯化后获得质量分数大于90%的纯蛋白。与细菌PanD相比，古细菌ADC不需要自剪切作用，因此其电泳图仅为一条条带。酶活测定结果显示：ADCT.k，ADCP.h和ADCM.j的比酶活分别为5.85，6.46，6.87 U/mg，其中ADCM.j具有较优的表达量和酶活力，而且ADCM.j纯化后酶液颜色呈淡黄色，说明该酶本身对PLP有很强的亲和力，因此后续实验主要对其酶学性质和转化能力进行考察。

图2 PLP依赖型重组酶的纯化Fig.2 Purification of PLP-dependentL-aspartate -decarboxylase

2.3 重组酶的最适温度及温度稳定性

重组酶ADCM.j在不同温度条件下的比酶活如图3所示。由图3可知：酶活随着温度的升高呈先上升后下降的趋势，最适温度为80 ℃，37 ℃时的酶活极低，该酶为高温酶，低于60℃时温度敏感性较强。稳定性实验结果显示：重组酶在80 ℃以下水浴中放置12 h酶活均没有损失，超过80 ℃酶活损失非常快，90 ℃时只剩下50%。由以上实验结果可知：重组酶ADCM.j催化L-天冬氨酸的脱羧反应的最适温度为80 ℃，该酶在80 ℃以下保持稳定，具有良好的热稳定性。目前报道的最适合工业化应用的酶为来源于枯草芽孢杆菌的重组酶PanDB.s，其最适温度为60 ℃，65 ℃条件下12 h的酶活损失为27%[7]，相比于PanDB.s，ADCM.j具有较好的热稳定性。

图3 重组酶ADCM.j的最适温度及温度稳定性Fig.3 Optimal temperature and thermostability of ADCM.j

2.4 重组酶的最适pH及pH稳定性

重组酶ADCM.j在不同pH条件下的比酶活如图4所示。由图4可知：随着pH的增加，酶活呈先上升后下降的趋势，最适pH为8.0。最适pH下在Tris-HCl缓冲液中测定的酶活比在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中的高，但是12 h后酶活略低，说明Tris-HCl缓冲液有利于催化反应，但不利于酶的稳定性。pH稳定性实验结果显示该酶在中性和碱性条件下有较好的稳定性。

L-天冬氨酸本身溶解度不高，因此底物以其钠盐形式加入反应体系，pH呈中性。理论上ADC在催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸和CO2的过程中需要消耗溶液中的质子，从而导致pH逐渐增加。因此，从pH及pH稳定性来看，碱性条件下稳定的酶更有利于催化反应的进行。相对于PanDB.s(最适pH 6.5)，重组酶ADCM.j在催化反应中更有优势。

图4 重组酶ADCM.j的最适pH及pH稳定性Fig.4 Optimal pH and stability of ADCM.j

2.5 辅酶PLP稳定性考察

在酶学性质及酶活测定实验中，笔者发现如果将辅酶PLP和L-天冬氨酸钠先预热，再加入酶反应，测得的酶活力非常低，因此可以考虑底物对辅酶PLP的稳定性有一定的影响。辅酶PLP是氨基酸代谢中一些重要转氨酶和脱羧酶的辅酶[17-18]，是一种不稳定的辅助因子，见光易分解且热稳定性不高，高温条件下吡哆醛可以与α-氨基酸反应生成吡哆胺，从而失去生理活性[19]。考虑到PLP在390 nm处有最高吸收峰[20]，实验通过测定不同底物浓度、温度和不同pH条件下A390 nm(390 nm处的吸光值)来考察辅酶PLP的稳定性，实验结果如图5～7所示。由图5～7可知：1) 37 ℃条件下PLP与底物接触既开始降解，底物浓度越高，PLP的降解越快。底物浓度为500 mmol/L时，3 h时其A390 nm降低了15.2%；2) PLP对高温特别敏感，80 ℃ 2.5 h即可以完全被降解；3) 酸性条件下，PLP很容易被降解，pH 6.0时4.5 h降解了37.5%。即底物浓度较高时辅酶PLP的降解不可避免，在较低温度和碱性条件下相对较稳定。

图5 底物浓度对PLP降解的影响Fig.5 Effects of L-aspartate concentrationon PLP degeneration

图6 温度对PLP降解的影响Fig.6 Effects of temperature on PLP degeneration

图7 pH对PLP降解的影响Fig.7 Effects of pH on PLP degeneration

2.6 重组酶酶催化实验

不同底物浓度下重组酶的转化获得β-丙氨酸的产量如图8所示。由图8可知：随着L-天冬氨酸浓度的升高，产物浓度逐渐降低，底物对重组酶酶活有抑制作用，底物浓度越高抑制强度越强。反应12 h后其抑制趋势与2 h时的一致，且产量均增加了50%左右，说明酶反应速率大幅降低但未完全失活。同样的抑制作用也存在于细菌PanD的催化反应中，但细菌PanD的底物抑制为不可逆的失活作用[4-5]。

为了验证ADCM.j的底物抑制作用是否可逆，进行了不同PLP量下的酶催化实验，实验结果如图9。在增加一倍PLP添加量后反应8 hβ-丙氨酸的产量增加了26.7%，说明过量添加PLP能够缓解底物抑制作用。另外，在没有额外添加PLP时ADCM.j仍然具有催化活性，说明该酶在细胞体内本身能与PLP有效结合，且在纯化过程中不会被破坏。最终，该酶催化8 h后获得了质量浓度为2.33 g/L的β-丙氨酸，其单位生产速率为0.116 g/(L·h·mg)，比PanDB.s的单位生产速率(0.071 g/(L·h·mg))提高了63.9%。

图8 底物浓度对酶催化的影响Fig.8 Effects of L-aspartate concentrationon bioconversion of ADCM.j

图9 重组酶的酶催化Fig.9 Bioconversion of ADCM.j

PLP依赖型ADC在β-丙氨酸生物合成过程中的明显优势是其温度稳定性和pH稳定性均优于细菌PanD，其底物抑制与辅酶相关，可以通过增加辅酶量获得底物抑制的解除，大大提高酶制剂的操作稳定性。由于PLP价格昂贵，消耗PLP生产β-丙氨酸并不经济，因此酶催化过程中PLP的稳定性和循环利用是利用PLP依赖型ADC合成β-丙氨酸研究的关键。借鉴目前工业上利用假单胞菌L-天冬氨酸β-脱羧酶在生产L-丙氨酸上的优势，利用耐高温的菌体酶进行活细胞转化是一个很可行的方案。

3 结 论

笔者利用基因合成技术成功构建了3种古细菌来源的磷酸吡哆醛依赖型L-天冬氨酸α-脱羧酶的重组菌，对其中活性较高的詹氏甲烷球菌来源的重组酶ADCM.j进行了酶学性质分析和酶催化研究。实验结果表明：重组酶ADCM.j虽然比酶活在目前报道中并不是最高的，但其温度稳定性和pH稳定性均优于细菌来源的PanD酶，并且在酶催化过程，酶不会与底物反应导致酶的不可逆失活，因此ADCM.j酶的催化稳定性优于PanD酶。笔者同时考察了不同底物浓度、温度以及pH条件对辅酶PLP的稳定性的影响，根据酶活性质及辅酶稳定性分析结果，最终利用重组酶ADCM.j进行催化L-天冬氨酸获得了质量浓度为2.33 g/L的β-丙氨酸，单位生产速率达到0.116 g/(L·h·mg)。对利用PLP依赖型ADC生产β-丙氨酸的可能性进行了研究，将其与细菌PanD的性能进行比较，为酶法生产β-丙氨酸提供可靠的催化剂选择，为酶催化条件提供有利的参考。