聚β-羟基丁酸酯提取方法研究进展

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(1.哈尔滨商业大学 食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.中国科学院 兰州化学物理研究所羰基合成和选择氧化国家重点实验室，甘肃 兰州 730000)

聚β-羟基丁酸酯(PHB)是聚羟基链烷酯(PHA)的典型代表[1]。PHA是一种高分子聚合物，在其结构通式中n=1时，R为甲基，单体为β-羟基丁酸(HB)，其聚合物为聚β-羟基丁酸酯(PHB)[2]。PHB是由多个D型3HB单元组成。在原核微生物缺乏氮、磷、镁和氧等造成营养不均衡时，PHB是细胞内形成的碳源和能源贮藏物质[3]。因PHB的生物相容性，其在很多领域被广泛应用。PHB在生产抗癌新药中，可作为中长期药物控制释放载体[4]。PHB可以作为药物基质植入人的体内，用来控制药物的释放速率。当人体服用了这种药以后，随着药物在体内完全释放，作为药物基质的PHB就会自然降解，其最终降解产物为β-羟基丁酸[5]。这是人体血液中一种普遍存在并且无毒、无害的代谢产物，不会给人体带来任何危险。在软骨组织工程中，细胞载体材料由PHB三维支架充当[6]。这样软骨基质明显增多，且死细胞较少。PHB本身具有生物可降解性，使得PHB成为了石油质塑料最有潜力的替代品。在农业方面，PHB可以用作农药和肥料的杀菌载体[7-8]。例如除锈剂、杀虫剂等。PHB主要由微生物发酵法制备，不依赖石油化工行业。随着全球石油储量的减少，国内外对这种可降解的生物材料的研究十分重视。在国外，PHB生产可降解瓶子的项目已经获得欧盟的资助[9-10]。在国内，利用甲烷氧化混合菌可以生物合成PHB。采用充盈-饥饿模式间歇供料，以甲烷为底物好氧开放式培养甲烷氧化混合菌HD6T。在开放条件下，对菌群中高产PHB的甲烷氧化菌进行富集。根据发酵罐培养细胞的生长规律，建立了开放条件下一段式的发酵罐发酵生产PHB的方法[11]。除了利用微生物发酵生产PHB，还可以利用转基因植物生产PHB。目前，PHB关键酶基因已在拟南芥、大白菜等植物中成功表达[12]。PHB常用的提取方法有溶剂提取法、酶法、次氯酸钠氯仿提取法、高压匀浆法和珠磨法。近年来，一些其他的提取方法也逐步发展起来，如噬菌体裂解法、基因工程法和活性污泥提取法等。笔者对这些提取方法进行介绍，并展开比较分析，进而展望PHB提取方法的发展方向，为PHB工业化生产提供一定的参考。

1 常用的PHB提取方法

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法是最传统的PHB提取方法。这种方法研究时间最长，应用比较广泛。溶剂提取法的原理是将PHB溶解在氯仿等氯代烃共沸物、环碳酸酯和四氯呋喃及其衍生物等有机溶剂中，因为非PHB的细胞物质不能溶解，从而达到分离提取的目的[13]。不同的有机溶剂，PHB的提取率不同。薛林贵等[14]研究SDS法、次氯酸钠法、SDS-次氯酸钠法、CHCl3法和CHCl3-CH3OH法对芽孢杆菌胞内PHB提取率的影响，实验结果如表1所示。CHCl3法和CHCl3-CH3OH法属于溶剂提取法，PHB的提取率分别为38.6%和51.3%。采用不同种类的有机溶剂提取PHB，其提取率相差很大。这种方法的优点是操作流程比较简单，操作步骤少，但是也存在一些缺点，如PHB在某些有机溶剂中的溶解度较低，易造成提取困难，提取率偏低；有时需要提高有机试剂的用量，不但生产成本会随之提高，而且也会造成一定程度的环境污染；当培养物黏度过高时，采用有机溶剂分离提取PHB会有一定的困难。通过采用混合培养技术培养菌种，则可以解决这一问题。混合培养技术是指人工建立微生物区系，利用两种或两种以上的微生物不同特性，加以调节控制，从而达到所需目的的技术[15]。将两种或两种以上的菌种混合培养，通过有机溶剂改变细胞膜的通透性，根据PHB和非杂质溶解度的不同，提取PHB[16]，需要注意的是菌体需采用低温冷冻技术进行预处理。这种混合培养技术可以有效改善培养液介质，增加培养物密度，提高PHB质量和降低PHB生产成本。

表1 提取方法对胞内PHB提取率的影响Table 1 The effect of extraction method on theextraction rate of PHB

1.2 酶法提取PHB

酶法提取PHB的工艺是由Mothes等[17]研究发现的，他们利用酶使微生物细胞内大量的杂质溶解，细胞内的PHB在此过程中不溶解，最后达到分离、提取PHB的目的。酶法工艺流程主要包括细胞的热处理、酶处理和用阴离子表面活性剂处理等步骤[18]。酶法可以筛除非PHB杂质，不需使用大量的有机溶剂，操作过程几乎没有污染。但是也存在一些缺点，酶的最适作用条件比较苛刻，酶产物存在抑制问题，很难控制，造成PHB的提取率偏低。将酶法与溶剂提取法结合起来，可以提高PHB的提取率。在酶法提取PHB之后，利用氯仿等有机溶剂进一步进行纯化[19]，可以获得更高纯度的PHB，即可解决单一酶法PHB提取率低，纯度不高等问题。

1.3 次氯酸钠氯仿法

次氯酸钠氯仿法是一种比较常见的提取PHB的方法。次氯酸钠的主要作用是破除微生物的细胞壁，氯仿的作用是保护PHB[20]。许旭萍等[21]采用次氯酸钠氯仿法提取球衣菌内的PHB。将菌体从发酵液中离心出来并用蒸馏水洗涤，湿菌体分别用次氯酸钠，SDS-次氯酸钠处理。处理结束后，将这些湿菌体分别离心，离心得到的沉淀分别用蒸馏水和丙酮洗涤，烘干后用氯仿抽提。实验结果表明，SDS-次氯酸钠-氯仿混合处理的PHB提取率为56%，与仅用次氯酸钠氯仿处理的PHB提取率相当。但是，SDS-次氯酸钠-氯仿混合处理提取的PHB纯度明显提高，基本与标准品一致。SDS首先作用于脂类和蛋白质，使细胞膜受到破坏，次氯酸钠可破坏细胞壁的网状结构使之成为溶于水的物质，增大非PHB杂质的去除率[22-23]。李凌凌等[24]以魔芋多糖为碳源产PHB的菌株筛选、鉴定及发酵研究中，采用次氯酸钠氯仿法提取PHB。实验结果表明，菌体LKH在氮源质量浓度为0.2 g/L，以魔芋多糖为唯一碳源合成的PHB质量浓度高达0.85 g/L，PHB提取率为93.29%。这种方法操作比较简便，在提取时加入SDS与次氯酸钠混合处理菌体，可以缩短次氯酸钠与PHB的接触时间，保护PHB分子，提高PHB的提取率和纯度。但是，氯仿有特殊气味，易挥发，操作过程需要注意安全。

1.4 酶法、溶剂提取法和次氯酸钠氯仿法的比较

酶法、溶剂提取法和次氯酸酸钠提取法都是比较常用的PHB提取方法，这3种方法的比较如表2所示。

表2 酶法、溶剂提取法和次氯酸酸钠提取法的比较Table 2 Comparison of enzymatic extraction, solvent extraction and sodium hypochlorite extraction

1.5 机械破碎提取PHB

机械破碎提取PHB主要利用高压匀浆法或者珠磨法破碎微生物的细胞壁，进而达到提取细胞内PHB的目的。高压匀浆法利用高压匀浆机对物料进行挤压和剪切，从而达到细胞破碎的目的[25]。高压匀浆法处理量比较大，且破碎效率较高，处理的速度也较快。珠磨法采用珠磨机破碎细胞，利用珠子和细胞之间相互剪切碰撞，达到细胞破碎的目的，通过珠液分离器，使细胞的浆液流出，进而提取微生物细胞中的PHB[26]。珠磨法与高压匀浆法的特点比较如表3所示。

表3 珠磨法和高压匀浆法的比较Table 3 Comparison between bead milling method and highpressure homogenization method

2 PHB的其他提取方法

2.1 螯合剂法提取PHB

Carla等[27]提出了用于优化生产经济的MINLP模型。在该模型中以微藻的生物精炼为基础，以甘油为原料生产生出柴油和PHB等产品。提取PHB的方法选择表面活性剂-螯合剂的提取方法。随着表面活性剂-螯合剂的加入，细菌外膜不稳定，发生破裂，与二价阳离子形成配合物。在细胞裂解后，也可以通过添加二乙基琥珀酸酯(DES)提取PHB。在这个模型中，PHB作为酯交换反应的副产物来获得，其生产水平由生物柴油间接决定。

EDTA作为一种螯合剂，具有很多独特的性质。其可以螯合金属离子，还可以破坏细胞膜脂多糖稳定结构[28]。在研究从甲烷氧化混合菌中提取PHB时，选用EDTA作为提取剂，操作流程如图1所示。这种方法利用甲烷氧化混合菌积累PHB，有效节约了PHB的生产成本，同时也减少了向环境中排放污染物。利用EDTA提取甲烷氧化菌内的PHB，有效地提高PHB产量，提取的过程不使用有机溶剂，不仅可减少操作过程中的安全隐患，而且可以更好地保护环境[29]。

图1 EDTA提取PHB流程图Fig.1 Flow chart of EDTA extracting PHB

2.2 噬菌体裂解法

噬菌体在自然界中广泛存在，并且可以特异性识别其宿主细胞。正是因为这种特异性，可以通过噬菌体裂解细胞，使得细菌内富集的PHB释放。噬菌体作为一种提取剂，提供了一种PHB提取的新方法。Hand等[30]使用细菌噬菌体作为提取剂，成功提取假单胞菌中富集的PHB。该方法不需要加入化学试剂，也不需要借助外力，就可将细胞内的PHB提取出来。通过短期的营养处理，就可以使细胞裂解，节约了PHB的提取成本。但是，这种噬菌体介导裂解的方法只能释放PHB总积累量的2/3，PHB的提取率较低。由于受到疏水作用的相互影响，导致PHB的不完全释放。因此，还需进一步针对该问题进行研究，开发更优化的方法，最大化地提取PHB。

2.3 从活性污泥中提取PHB

在自然界中，绝大部分微生物在一定条件下都可以在细胞内积累PHB。Karthi等[31]从船舱底油污染的海水中分离出能够利用烃类废物生产PHB的细菌菌株，通过苏丹黑和尼罗红的染色证明了PHB的积累。然后，进一步优化所使用的BH培养基，PHB积累量可增加37%。近年来，从活性污泥中生产和提取PHB越来越受到关注。活性污泥常用于污水处理，它本身也具有良好的沉降性能和较大的比表面积等优点。活性污泥中的微生物可以作为发酵菌群，通过污水合成PHB[32-33]，可以有效地节约生产成本，免去操作过程中复杂的条件控制。沈俊宇[34]利用活性污泥筛选每种菌株产PHA的含量。其中最高产量的菌株，菌体质量浓度为1.172 g/L，最高PHA质量浓度为0.241 g/L。在从活性污泥中提取PHB的研究中，当PHB达到污泥干重的4.86%时，提取的PHB纯度在70.6%以上。由于活性污泥中成分复杂，会影响PHB的提取率，在一定程度上增加了提取难度。但是，随着研究的不断深入，这些问题都会得到解决。

2.4 超声波破碎法

超声波破碎法是发射超声波，通过探头处理细胞悬浮液，从而进行细胞破碎的方法[35]。其原理是液体在超声波的作用下会发生空化作用，通过形成空穴、增大空穴和闭合空穴产生巨大的冲击波和剪切力，从而使微生物细胞破碎[36-37]。超声破碎微生物细胞后，细胞悬液的流动性显著提高。同时，长细胞链断裂成短细胞链，具有一定的破壁效果。这种超声破碎法广泛地应用于实验室中[38]。Pradhan等[39]使用超声破碎的方法提取PHB，并用FTIR进行表征检测。干细胞中PHB的质量分数为8.10%～21.6%。PHB的提取率为6.85%～36.41%。但是仅使用超声破碎，PHB的提取率不高。超声破碎法与氯仿结合使用，则可有效提高PHB的提取率。张永杰等[40]用多种方法破碎假单胞菌，提取胞内PHB。SDS提取PHB的质量分数为30%，SDS-次氯酸钠提取PHB的质量分数为52.5%，次氯酸钠提取PHB的质量分数为50%。超声-氯仿法的预处理效果较好，PHB的质量分数为55%。超声破碎没有破坏PHB的分子结构，加入氯仿使得细胞中高分子量的PHB更容易被抽提出来，更有助于PHB的提取。

2.5 基因工程法

在植物中克隆合成PHB的关键酶基因，可以从植物的质体或者细胞质中分离得到PHB。目前在拟南芥、大白菜的叶片和种子中可以成功表达PHB的关键酶基因。同时，该基因在马铃薯、棉花和油菜等植物中也能够成功表达[41]。在E.coil大肠杆菌中导入合成PHB的关键酶基因，该基因也可成功表达。同时，因大肠杆菌的厚度对PHB的积累量有一定影响，导入可以改变细胞壁厚度的柠檬酸合成酶基因gltA，改变大肠杆菌的细胞壁厚度，可以得知，细胞壁增厚的大肠杆菌仅积累质量分数为25%的PHB，细胞壁变薄的大肠杆菌积累质量分数为93%的PHB[42]。利用基因工程法提取PHB不需要消耗发酵底物，也不需要复杂的发酵过程。不仅节约了生产成本，而且大大减少了生产过程中的污染。但是大量PHB的积累，会阻碍底物运输，影响植物的正常生长。重新导入的外源基因表达及表现出的相应功能存在一定的限制。不同种类物种之间也存在一些有待解决的遗传问题。因此，这项技术目前还没有在生产中大规模使用。

2.6 直接成型法

在工业加工中，在高温高压的条件下，微生物细胞破裂，PHB会发生交联聚合，同时与细胞残渣混熔，共同成型。在发酵过程中，当PHB的质量分数大于细胞干重的50%时，可将其压制成膜产物。这种方法获得的PHB，有良好的可塑性，比较适用于工业生产加工[43]。

2.7 化学法合成PHB

PHB的化学合成法有很多，通过化学催化法可制备PHB。双烯酮在催化剂Ru2Cl4[(S)-binap]2·ET3N的作用下进行非对称氢化可制得具有光学活性的β-丁内酯。β-丁内酯在催化作用下可以开环聚合制得PHB[44]。除了化学催化法，还可以通过氧化法得到单体3-羟基丁酸，然后以单体为原料聚合得到PHB。乙醛经羟醛缩合生成3-羟基丁醛，3-羟基丁醛在适宜的条件可被氧化成3-羟基丁酸。氧化剂可以选择双氧水、纯氧等[45]。化学催化法与氧化法的比较如表4所示。虽然化学法合成PHB可以在一定程度上提高PHB的产量，简化生产流程。但是，利用这种方法生产PHB，原料成本比较高，而且大多数的化学原料具有毒性。同时，化学反应的条件不是很好控制，会导致很多副产物的产生，对于PHB的分离提纯也会造成一定的困难。

表4 化学催化法与氧化法的比较Table 4 Comparison between chemical catalytic methodand oxidation method

2.8 PHB其他提取方法的比较

PHB的其他提取方法有螯合剂法提取PHB、噬菌体裂解法、从活性污泥中提取PHB、超声波破碎法、基因工程法、直接成型法和化学法合成PHB。这些提取方法的比较如表5所示。

表5 PHB其他提取方法的比较Table 5 Comparison of other extraction methods for PHB

3 结 论

PHB可以用来生产抗癌新药、作为三维支架充当细胞载体材料以及用作农药和肥料的杀菌载体，具有巨大的发展潜力。笔者介绍了多种PHB的提取方法，为降低PHB的生产成本，实现PHB的工业化生产提供了参考。在常用的提取方法中，次氯酸钠氯仿法是最适宜提取PHB的方法。相较于酶法的作用条件比较苛刻，溶剂提取法需使用大量的有机溶剂，次氯酸钠氯仿法的操作则比较简便，各种提取条件易于控制。同时，其PHB的提取率比较高，加入SDS混合处理后，PHB的纯度与标准品基本一致。其他的提取方法，如螯合剂法、噬菌体裂解法、从活性污泥中提取PHB、超声破碎法和基因工程法都不使用大量的有毒有害物质，更好地保护了环境。从活性污泥中提取PHB，在处理污水的同时也提取了PHB，变废为宝，节约了PHB的生产成本。直接成型法和化学法更适用于PHB的工业生产加工。但是化学法合成PHB时，会使用一些有毒的化学原料。目前，这些方法还需要进一步完善。在不久的将来，PHB的提取方法会更加无污染、低成本。随着研究的深入，PHB的提取方法将会越来越多，PHB的应用也会越来越广泛。