基于光谱技术的中药质量控制研究进展

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

中药的发明和应用,在我国有着悠久的历史。中药以其确切的疗效和完整的形成体系，在全球传统医学中独树一帜[1]。在过去的20年里，中药领域在针对临床试验评估、药理学机制、药剂学研究和新药研发等的研究中取得了很大进展，其对医疗保健的潜在影响引起了全球的广泛关注[2-4]。越来越多的消费者开始使用植物性药物，他们相信这些“天然”产品比传统药物“更安全”，许多大型制药企业都将其作为发现天然生物活性化合物的良好平台[5-8]。然而中药化学成分复杂，具有系统性、多靶点和多渠道的特点，在中药被全球范围接受之前，仍然面临着相当大的发展障碍[9]，挑战主要来自安全性和有效性方面。与传统西方医学不同，中药处方通常包括多种中药，混合后在水中煮沸，每种都含有大量(活性)成分，多种特征成分协同作用，其相对浓度受品种、产地和加工工艺等一系列因素的影响[10-11]。其化学成分多样性的特点给分析化学家在寻找不同批次中药可靠度和灵敏度的质量控制方面带来多重挑战[12-13]。目前中药仍存在产品质量不合格、基础研究力度不够以及规范和标准不完善等问题。如何选择中药发展的最适合方式以满足现代中药发展的需要，是目前研究的重点。显然，完全沿用西方单一化学成分药物的质量控制方法并不可行，亟需建立一套符合中药特色的质量管理体系规范[14]。目前，国内外研究者主要采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)[15-16]、气相色谱法(Gas chromatography，GC)[17]、薄层色谱法(Thin layer chromatography，TLC)[18]、高速逆流色谱法(High-speed countercurrent chromatography，HSCCC)[19]和生物方法[20-21]对中药的质量控制进行分析。然而这些传统化学检测方法也存在一些不足，例如高效液相色谱仪的色谱柱较小，且溶质在液相中的扩散系数很低，进样方式和柱后扩散等都会对柱子的效能产生影响；薄层色谱处于一种完全开放的系统中，很容易受到环境的影响，造成分离效果不理想。这些色谱方法在操作前都要进行繁琐的预处理，基本上都要经过有机溶剂的提取后才能进行测试，且需要准备多种有机溶剂，不仅造成了额外的费用，而且测定过程费时、费力，仅能抽样检测，无法实现大规模的信息获取，更不能进行实时地在线监测。因此，寻找和使用快速、绿色和能大规模科学获取中药材信息的检测方法是当代中药产业长远发展并和国际接轨的迫切需求。近年来光谱技术迅速发展，在多组分混合物分析中可以达到更高的分辨率，越来越多地被应用于农产品、食品和药品等领域的质量分析。大多数光谱法都能实现对中药样本的直接分析，无需额外分离提取，不仅对环境友好，而且降低了有机溶剂对中药有效成分产生不良影响的可能性。另外，因为效率高且仪器操作难度较低，还可实现在线监测。笔者针对目前光谱技术在中药领域的主要研究方法进行总结和概述，为其在中药质量控制中的应用提供参考依据。

1 光谱范围概述

光谱是复色光经过色散系统的分光，被色散之后形成的单色光按照波长或频率大小依次排列的图案。光谱按照频率从小到大依次可分为无线电波(频率约104～3×1010Hz)、微波(频率约3×108～3×1011Hz)、太赫兹(频率约3×1011～3×1012Hz)、红外光(频率约1×1012～4×1014Hz)、可见光(频率约4.2×1014～7.8×1014Hz)、紫外光(频率约7.9×1014～3×1016Hz)和X射线(频率约3×1016～3×1020Hz)等。

2 常用光谱分析方法

2.1 紫外光谱法

紫外光谱(Ultraviolet spectroscopy，UVS)是基于π→π*，n→π*以及n→δ*电子能级跃迁，测定物质分子在紫外光区吸收光谱的分析方法。其不仅可以区分结构差异很大的物质，还可以鉴别结构相似的化合物。而且在定量方面，可同时测定多种组分，检测限低、灵敏度高，已被广泛地应用于中医药质量研究中[22]。

王元忠等[23]从10个不同产地共收集50个三七样本，获取并分析了50个样本的紫外光谱，如图1(a)所示，不同产地的三七紫外指纹图谱在峰形和强度方面都存在差异，并分析得出三氯甲烷提取溶液的紫外光谱精密度的变异系数相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)是0～0.42%，稳定性变异系数RSD是0～0.60%，重复性变异系数RSD是0～0.54%。进一步将紫外图谱与偏最小二乘判别分析(Partial least square discrimination analysis，PLS-DA)相结合，如图1(b)所示，该方法可以很好地将任意不同产地的三七区分开，且分析得出三七的主要成分含量差异与产地差异具有相关性，这为三七的产地鉴别提供了参考。Huang等[24]基于UVS研究了一种测定中药注射剂中单宁含量的方法。采用化学计量学方法构建丹参和冠心宁注射液的紫外吸收光谱和单宁参考含量的偏最小二乘回归数学模型，结果显示，相关系数r为0.952，校准集均方根误差为0.476 μg/mL，验证集的均方根误差为1.171 μg/mL，预测集的均方根误差为0.465 μg/mL。该模型表现良好，建立的基于紫外光谱法测定单宁含量的方法简单、快速、可靠，为中药注射剂中单宁的质量控制提供了技术支持。

图1 不同产地三七的紫外光谱图和PLS-DA得分图Fig.1 UV spectra and PLS-DA scores mapof Panax notoginseng from different origins

2.2 红外光谱法

红外光谱(Infrared absorption spectroscopy，IR)根据不同物质会选择性地吸收红外光区的电磁辐射进行结构分析，从而对各种吸收红外光的化合物进行定性和定量分析[25]。理论上，每种物质结构不同，都应该有其独特的红外光谱[26]，然而中药化学成分复杂，其红外光谱由多种复杂成分叠加构成。

Wu等[27]采用近红外光谱技术对水牛角水解过程中氨基酸浓度情况进行在线监测，结合化学计量学建立了区间偏最小二乘(Interval partial least squares，iPLS)和协同区间偏最小二乘(Synergy interval partial least squares，SiPLS)的近红外线性模型。此外，还利用两种误差确定了优化模型的多元量化极限值，结果显示l-脯氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸、l-苯丙氨酸和l-赖氨酸的SiPLS模型的预测集均方根误差值分别为0.091 5，0.160 5，0.051 5，0.058 6，0.061 3 mg/mL，多元量化极限值范围为9×10-4～81×10-4，说明这些模型可适用于大多数阳离子。Chen等[28]基于傅里叶变换红外光谱、二阶导数红外光谱和二维相关红外光谱研发出一种快速鉴别野生金线莲、栽培金线莲和组织培养金线莲的方法，3种模型识别率均高达100%。此外，这3种模型不仅可以识别金线莲样品和标准草药，还可以识别金线莲植物。Chen等[29]采集4个不同省份的250个三七样本的近红外光谱，并将其平均分为建模集和预测集。标准正态变换和一阶导数用于光谱的预处理，使用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和相似分类法(Soft independent modeling of class analogy，SIMCA)两种化学计量学算法来构建判别模型。构建的PLS-DA模型在建模集和预测集上实现100%灵敏度和100%特异性，这表明标准正态变换加一阶导数预处理结和PLS-DA算法可以作为快速区分三七地理来源的一种方法。李运等[30]基于傅里叶变换红外光谱获取了三七主根、剪口和须根的红外光谱，如图2(a)所示，3个部位的红外光谱极为相似，难以区分，因此将3条光谱都进行二阶导的预处理，如图2(b)所示，分离了隐蔽的叠峰，提高了分辨率。基于二阶导处理的光谱，建立支持向量机(Support vector machine，SVM)的判别模型，如图3所示，建立的SVM模型可以区分三七主根、剪口和须根，判别正确率为100%。

1—主根；2—剪口；3—须根图2 三七主根、剪口和须根的红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of the main root, rhizome and fibrous root of Panax notoginseng

1—主根；2—剪口；3—须根图3 验证集分类结果Fig.3 Classification result of validation set

2.3 拉曼光谱法

拉曼光谱(Raman spectra)分析法是基于印度科学家C.V.拉曼(Raman)发现的拉曼散射效应，应用于分子结构研究的一种分析方法[31]。该方法分析速度快、精准度高，且不受水的影响，已被广泛应用于中药材的真伪鉴定以及定量分析等方面。但是一些中药有很强的荧光性，拉曼散射信号弱，荧光的强度甚至比拉曼散射的强度高出好几个数量级，拉曼的信号极有可能被荧光信号所掩盖，限制了该技术在这些中药研究分析中的应用。

张凡等[32]采集10批白石英的拉曼光谱，进行相似度评价，很好地区分了正品白石英和伪品白石英。Qi等[33]获取了葛根素的拉曼光谱，如图4所示，建立了以葛根素在1 628 cm-1特征波数处的峰强与乙醇在880 cm-1特征波数处的峰强比值与葛根素浓度的线性关系方程(Y=5.830 38X+4.047 8×10-4，R2=0.999 3)，如图5所示，快速定量分析出葛根中的葛根素含量。De等[34]探究了大黄、柑橘和巴戟天等草本植物的提取物的表面增强拉曼散射光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)与所提取出的染料分子结构的关系，他们发现每种染料分子都有特征峰位，这为染料的鉴别提供了参考方法。Zhao等[35]使用银纳米球作为SERS活性探针，分析了黄连和黄檗的原始煎剂及其伪造品，用密度泛函理论(Density functional theory，DFT)计算小檗碱的预期拉曼光谱，液质联用仪来分析样品中小檗碱的量，结果显示SERS测量的结果与DFT计算和液质联用仪分析的结果一致。Chen等[36]将霍雪花汤按照不同疗效分为调和药物汤剂、华玉生心药汤剂组、活血止咳药汤组和补气药组煎剂等4组药物汤剂，获得并分析了这4种药物组汤剂以及霍雪花汤的SERS光谱，初步分析了这5种煎剂的特征拉曼谱带，结果显示药物组煎剂的SERS光谱中的一些拉曼谱带保留在霍雪花汤中，然而1 077，1 145，1 245 cm-1等拉曼谱带从未出现在霍雪花汤SERS光谱中，这说明药物组煎剂产生了新的成分。结果表明，霍雪花汤中的医药成分并不仅是4组药物组的简单添加，拉曼光谱可以有效、准确地研究药物组，在中药药物活性成分研究领域具有很大的潜力。

图4 葛根素拉曼光谱图Fig.4 Raman spectrum of pure puerarin

图5 波数强度比值与乙醇中葛根素浓度校准曲线Fig.5 Calibration curve for the ratio of band intensityto concentration of puerarin in ethanol

2.4 激光诱导击穿光谱法

激光诱导击穿光谱(Laser-induced breakdown spectroscopy，LIBS)是一种以最小样品制备量对固体、液体、气体和气溶胶等多种材料进行多元素分析的直接光谱技术[37]。它对高能激光脉冲引起的等离子体进行分析以确定样品的物质成分及含量，具有远程、实时的分析特点，这些特点使得LIBS的应用越来越广泛。

Liu等[38]基于LIBS的信号相对强度变化率和移动窗口标准差测量了朱砂和雄黄两种矿物药的配伍变异性，同时，基于电感耦合等离子体发射光谱方法，得到了相对浓度变化率。LIBS与电感耦合等离子体发射光谱在两种矿物药混合终点测定结果一致，且LIBS比电感耦合等离子体发射光谱法测定过程更简单、快捷，证明LIBS在监测中药生产过程中有很大的潜力。Wang等[39]采集了川穹的LIBS光谱，如图6(a,b)所示，并研究了川穹中铅和铜等重金属的含量，建立了LIBS光谱强度与铅和铜质量分数之间的多元线性回归模型，如图7(a,b)所示，确定了二者的检测限，精准度高，为中药重金属的含量测定提供了参考方法。Zhao等[40]基于LIBS获取了未经硫熏蒸、轻度硫熏蒸和重度硫熏蒸的贝母样品的光谱数据，并通过归一化和小波变换进行预处理，在特征波段和全波段基础上建立了极限学习机、随机森林和支持向量机的识别模型。结果显示，特征波段结合支持向量机模型校准集和预测集精度分别达到100%和95.83%，说明LIBS技术结合化学计量学方法在中药鉴定方面有深度研究的潜力，也为中药鉴定提供了指导方法。

图6 川穹LIBS图Fig.6 LIBS spectral of Ligusticum wallichii

图7 LIBS光谱强度与铅和铜质量分数之间的校正曲线Fig.7 Calibration curve for Pb and Cu in Ligusticum wallichii

2.5 高光谱成像法

高光谱成像技术(Hyperspectral image，HSI)是一种能够同时分析样品的化学和物理性质的强大而独特的技术[41]，用于捕获样本中的某成分的空间分布，在中药分析领域常用的光谱范围是380～2 500 nm。HSI对电磁频谱中包含的信息进行汇编和处理，从而对样本进行研究分析[42]。近年来，HSI技术作为一种分析工具在农业、食品和中医药等领域得到越来越广泛的应用。

Xia等[43]基于HSI技术结合10种不同波长选择方法(连续投影算法、回归系数、无信息性变量消除、载荷权重、无信息性变量消除联合连续投影算法、竞争性自适应重加权采样、区间偏最小二乘回归、后向区间偏最小二乘回归、前向区间偏最小二乘回归和遗传算法)建立PLS-DA模型对浙麦冬和川麦冬进行产地鉴别分析。结果显示，竞争性自适应重加权采样法结合PLS-DA模型判别效果较好，判别准确度为98.2%。进一步以10种特征波长选择方法为基础建立支持向量机非线性鉴别模型，并且与PLS-DA模型判别效果进行比较，结果表明，遗传算法结合支持向量机模型的判别效果最好，准确度是99.1%。Sandasi等[44]采集不同原料混合物的草药茶在短波红外区的高光谱图像，结合化学计量学，建立了PLS-DA的判别模型，模型预测正确率为95.8%，并且通过分析确定了草药茶的主要成分。He等[45]利用近红外高光谱成像法采集浙贝母的高光谱图，如图8所示，并结合4种特征波长选择方法(连续投影算法、加权回归系数法、竞争自适应重加权采样和随机蛙跳)构建3种回归模型(偏最小二乘、最小二乘支持向量机和极限学习机)测定硫磺熏蒸的浙贝母中贝母素甲和贝母素乙的含量，结果显示大多数模型的相关系数都在0.8以上。将回归模型应用于高光谱图像中，形成了浙贝母中贝母素甲和贝母素乙含量的预测图，如图9所示。结果表明，高光谱成像结合化学计量学方法有助于开发一套适用于中药质量控制的在线监测系统。

图8 浙贝母高光谱图Fig.8 Spectral of Fritillaria thunbergii bulbi samples

图9 浙贝母灰度图以及贝母素甲和贝母素乙含量预测图Fig.9 Pseudo image of Fritillaria thunbergii bulbi and prediction map of peimine and peiminine

2.6 太赫兹光谱法

太赫兹(Tera Hertz，THz)频率为0.1～10 THz[46]，处于微波区和红外区之间，不仅具有相干特性，可能得到与其位相相关成分的信息，还在远红外区有拓展，可辅助红外光谱的分析[47]。多数中药的代谢产物在太赫兹波谱区都有特定的光谱信息，可以根据每种成分特定的太赫兹图谱来鉴别不同成分的中药。

田珺宏等[48]研究了经硫磺熏蒸与未经硫磺熏蒸的白芷的太赫兹光谱，通过主成分分析，主成分为3～5个时所表示的三维图中可以很好地将这两者区分开来，利用支持向量机的分类方法，判别准确率为100%。田珺宏等[48]继续以川穹和扶穹为模型药材，采集了两者的太赫兹时域光谱，利用线性核支持向量机、多项式内核支持向量机、高斯核函数支持向量机和近邻法建立模型进行分类分析4种模型的判别准确率分别为97.2%，99.9%，99.9%和99.8%，该结果为太赫兹时域光谱在中药鉴定方面的研究提供了参考依据。杨帅等[49]采用主成分分析(Principal component analysis，PCA)技术量化了大黄炮制品的不同性，并且确定了这种变化是由鞣质和蒽醌这两种成分的改变所引起的。胡清宇等[50]获取了生大黄、熟大黄、大黄炭和酒大黄的太赫兹光谱。并基于PCA对生大黄、熟大黄、大黄炭和酒大黄炮制前后对中药疗效的影响进行分析，如图10所示，得到的结果与TLC方法得到的结果一致。周永军等[51]基于太赫兹时域光谱技术，以黄芪、当归、杜仲以及掺杂了黄芪、当归、杜仲的混合药物共4组药物为模型药物，分别进行了鉴别。Li等[52]收集了三七与当归、厚朴与百倍鹅掌柴、川穹与藁本以及当归与毛当归等4组中药材的太赫兹光谱，针对中药材的太赫兹光谱吸收峰重叠无法鉴别的情况提出了K-means回归，K-medoids回归以及FuzzyC-means回归等3种无监督聚类方法，与监督学习分类方法互为补充。一阶导数的预处理方法可以放大不同成分吸收系数在整体或局部方面微小的差异。对每组中的2种中药材进行区分，结果显示，使用一阶导数为原始吸收系数预处理方法，3种聚类算法判别率都很高，其中K-means算法效果最好，总体判别正确率为95.32%。表1为光谱技术结合术化学计量学在中药质量研究分析中的应用举例。

图10 4种大黄炮制品PCA结果Fig.10 PCA result of four kinds of processed rhubarb products

表1 光谱技术结合化学计量学在中药质量研究分析中的应用举例1)Table 1 Examples of the application of spectral techniques combined with chemometrics inthe study and analysis of the quality of traditional Chinese medicine

注：1)ANN表示artificial neural network/人工神经网络；BP-ANN表示backpropagation artificial neural network/反向传播神经网络。

3 结 论

中药光谱具有模糊性和整体性两大特征，建立直观、全面、简易且准确的分析模型需要结合化学计量学方法。虽然光谱技术越来越广泛的应用于中药的质量研究中，但是光谱技术结合化学计量学方法建立定性或定量模型的准确度还不能完全达到100%，不过随着化学计量学的发展，准确度和精确度都在不断的提高。虽然光谱技术不会对中药有效成分产生不利的影响，在分析的过程中也不会产生额外的有机溶剂的费用，但是光谱技术也存在一些缺点，比如近红外光谱吸收峰严重重叠，难以指认，具有较宽的峰，一般不能用于定性分析；中红外光谱的谱峰虽易于指认，但是容易受环境中的热源影响而造成检测不准确；拉曼光谱容易受到荧光信号的干扰等。中药化学成分复杂多样，在治疗的过程中，多种药物的多种组分协同作用共同发挥疗效，而不是某一个单一组分发挥疗效，这也为中药的质量分析带来很大的障碍。但只要我们根据中药活性组分的理论基础，利用光谱技术结合化学计量学将中药的活性组分与药物生物效应相结合，全面分析中药的质量，中药在国际化舞台上的应用将会越来越广泛。