非达霉素产生菌种子工艺研究

(杭州中美华东制药有限公司，浙江 杭州 310011)

非达霉素(fidaxomicin)是一种新型窄谱的大环内脂类抗生素，能有效控制艰难梭状芽孢杆菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)[1-4]。非达霉素通过与RNA聚合酶结合抑制细菌繁殖，进而针对性抑制艰难梭状芽孢杆菌，其治疗效果优于传统药物万古霉素和甲硝唑，并且具有更高的治愈率及更低的复发率[5-8]。目前，非达霉素主要通过微生物发酵生产，相关研究主要集中在菌种改良、发酵条件及提取工艺优化方面，鲜有种子培养工艺方面的研究报道，而种子的制备是微生物发酵生产的第一道工序，因此，提供生产性能稳定且优良的种子液非常重要。现有报道的种子配方中大多含有牛肉膏和蛋白胨等动物性原料[9-13]，由于动物性原料存在潜在的病毒污染、成分不明确及不利于产物分离纯化等缺点，FDA对动物性原料要求非常苛刻，需要原料供应商通过CEP认证或出BSE/TSE声明，而多数厂家都不具备这一资质，因此，在生产过程中应尽量避免使用动物性原料，保障产品安全性。为了提高发酵产量及稳定性，同时，替代种子配方中的动物性原料，进一步提升产品质量及安全性，笔者对种子培养温度、种子配方进行优化，确定种子最佳培养温度，研究出无动物性原料的种子配方，同时对种子培养工艺进行细化，确定种龄及接种量，为发酵提供优质的种液，保证发酵稳定。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

桔橙指孢囊菌(Dactylosporangiumaurantiacum)为本公司保藏菌种。

1.1.2 培 养 基

固体培养基：葡萄糖4 g/L，酵母浸出粉4 g/L，麦芽浸粉10 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0。

种子培养基：可溶性淀粉25 g/L，酵母浸出粉5 g/L，牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，碳酸钙4 g/L，pH 7.0。

发酵培养基：乳糖50 g/L，甘油10 g/L，酵母粉10 g/L，棉籽饼粉10 g/L，大豆蛋白胨5 g/L，硫酸镁2 g/L，磷酸氢二钾5 g/L，碳酸钙4 g/L，pH 7.2。

1.2 培养条件

固体培养：将-80 ℃保藏的甘油管用无菌水稀释涂布于平板培养基上，30 ℃培养7～9 d。刮取长好的平板单菌落，制成菌悬液，取0.1 mL接入斜面培养基中，30 ℃培养5～7 d。

种子培养:将斜面菌体用无菌水制成菌悬液，接种于装有20 mL(250 mL摇瓶)种子培养基中，28 ℃，220 r/min振荡培养2～3 d。

发酵培养：将培养好的种液以10%接种量接入装液量为20 mL(250 mL摇瓶)的发酵培养基中，28 ℃，220 r/min振荡培养7～10 d。

1.3 实验方法

1.3.1 种子培养温度

为了确定种子的最佳培养温度，将新鲜斜面接入种子培养基中，分别放置在温度为24，26，28，30，32 ℃的摇床间进行培养，培养结束后分别接入发酵培养基中，检测种子液菌体生物量及发酵液非达霉素含量。

1.3.2 碳源的筛选

为了探究菌种对不同碳源的利用情况，考察了玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糊精和甘油等几种常见碳源对种子生长及发酵水平的影响。

1.3.3 动物性氮源替代实验

选用植物来源的蛋白胨及微生物来源的蛋白胨代替初始的动物性蛋白胨，在完成蛋白胨替代实验后，用玉米蛋白粉、棉籽精粉、多肽粉、麦芽浸粉和黄豆粉等几种常用的氮源进行牛肉膏替代实验，考查这几种氮源对菌体生长及发酵水平的影响。

1.3.4 一级种子生长曲线的测定

取生长良好的新鲜斜面，接种于种子培养基中，分别培养24，32，40，48，56，64，72 h，测定菌体生物量、pH和总糖等指标，通过显微镜镜检观察菌丝形态。以培养时间为横坐标，生物量、总糖和pH等为纵坐标，绘制一级种子生长曲线。

1.3.5 一级种子种龄实验

根据一级种子生长曲线，选取56，60，64，68，72 h 5个时间点，将对应的种子以10%的接种量分别接入发酵培养基中，考察种龄对发酵的影响，以发酵液中非达霉素含量来确定一级种子的最佳种龄。

1.3.6 二级种子种龄实验

为满足产品工业化生产需求，进行二级种子培养工艺研究。将培养56，64 h的一级种子液接入二级种子培养基中，分别培养32，40，48，56 h后接入发酵培养基，28 ℃，220 r/min振荡培养7 d，检测发酵液中非达霉素含量，确定最佳二级种子移种时间。

1.3.7 二级种子种量实验

将培养56 h的一级种子液按体积分数分别为0.05%，0.1%，0.15%，0.2%接入二级种瓶，二级种子培养48 h后接入发酵培养基，28 ℃，220 r/min振荡培养7 d，检测发酵液中非达霉素含量，确定最佳接种量。

1.4 检测方法

1.4.1 菌体生物量测定

菌体生物量采用菌体离心浓度(PMV)表示：取10 mL发酵液置于带刻度离心管中，3 500 r/min离心10 min，测定离心后菌体体积。

1.4.2 总糖含量测定

采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定总糖含量[14]。

1.4.3 非达霉素产量测定

取发酵液1 mL加入甲醇3 mL，混合均匀密封。超声处理30 min，吸取1 mL于12 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.45 (m的有机滤膜过滤后，HPLC检测非达霉素含量。

色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C8柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为V(乙腈)∶V(体积分数为0.5%的乙酸水溶液)=58∶42；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长230 nm；进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 种子培养温度

温度是影响微生物生长代谢的重要因素，通常培养温度偏低，菌体生长缓慢，菌体量偏少，影响发酵产量；培养温度偏高，菌体代谢活动加快，可以缩短培养时间，但菌体容易老化，影响发酵产量[15]。因此，为了获得优质种子液，需要确定菌种的最佳培养温度。温度对种子生物量及发酵效价的影响见图1。由图1可知：种子在24，26 ℃培养时，菌体生物量较低，生长缓慢，而在28～32 ℃培养时，菌体生物量较高。把不同温度下培养的种子接入发酵培养基中，检测发酵液中非达霉素含量。结果表明:在30 ℃下培养的种子具有较高的活性，发酵产量较高，因此，确定种子的最佳培养温度为30 ℃。

图1 温度对种子生物量及发酵效价的影响Fig.1 The effect of temperature on seedbiomass and fermentation titer

2.2 种子碳源筛选

碳源既是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素，又是提供微生物生命活动所需能源的原料[16]。微生物的生理特性不同，对碳源的利用情况亦不相同。为探究种子对碳源的利用情况，实验考察了玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘油等几种常见碳源对种子生长及发酵水平的影响。对种液进行生物量检测和镜检，结果表明：可溶性淀粉、玉米淀粉和麦芽糊精为碳源时，菌体生物量较高，镜检时菌丝较粗壮，染色较深。种子碳源对发酵效价的影响见图2。由图2可知：以可溶性淀粉和玉米淀粉为碳源时，发酵产非达霉素效价较高；以葡萄糖和甘油为碳源时，发酵产非达霉素效价较低。综合发酵水平、菌体生物量及镜检结果，最终选择玉米淀粉作为种子碳源。

1—可溶性淀粉；2—玉米淀粉；3—葡萄糖；4—蔗糖；5—麦芽糊精；6—甘油图2 种子碳源对发酵效价的影响Fig.2 The effect of seed carbon sourceon fermentation titer

2.3 动物性氮源替代实验

氮源主要是构成微生物细胞物质(氨基酸、蛋白质和核酸等)和含氮代谢产物[16]。初始种子配方中含有牛肉膏和蛋白胨两种动物性氮源，为了提高产品质量及安全性，实验采用几种常用氮源分别替代这两种动物性氮源，考查菌种对氮源的利用情况及其对发酵水平的影响。

2.3.1 蛋白胨替代实验

首先用植物来源的大豆蛋白胨及微生物来源的酵母蛋白胨FP101，FP102和FP103替代原始的动物性蛋白胨。通过生物量检测及镜检观察，发现3种型号的酵母蛋白胨均优于大豆蛋白胨。不同来源的蛋白胨对发酵效价的影响见图3。由图3可知：酵母蛋白胨FP102与蛋白胨在发酵水平上无差异，因此可用酵母蛋白胨FP102替代初始的动物性蛋白胨。

1—蛋白胨；2—大豆蛋白胨；3—FP101；4—FP102；5—FP103图3 不同来源的蛋白胨对发酵效价的影响Fig.3 The effects of peptone from different sourceson fermentation titer

2.3.2 牛肉膏替代实验

酵母蛋白胨FP102成功替代动物性蛋白胨后，选用玉米蛋白粉、棉籽精粉、多肽粉、麦芽浸粉和黄豆粉等几种常用氮源替代牛肉膏实验。不同氮源代替牛肉膏对发酵效价的影响见图4。由图可知：多肽粉替代牛肉膏时，发酵产非达霉素水平优于牛肉膏，综合生物量及镜检结果，最终以多肽粉替代牛肉膏。

1—牛肉膏；2—玉米蛋白粉；3—棉籽精粉；4—多肽粉；5—麦芽浸粉；6—黄豆粉图4 不同氮源代替牛肉膏对发酵效价的影响Fig.4 The effect of different nitrogen sources insteadof beef extract on fermentation titer

完成种子碳源筛选及动物性氮源替代实验后，确定新的种子配方为：玉米淀粉25 g/L，酵母浸出粉5 g/L，多肽粉3 g/L，酵母蛋白胨FP102 5 g/L，碳酸钙4 g/L，pH 7.0。以初始培养基为对照分别测定优化前后菌体生物量及接入发酵培养基后测定发酵水平。结果表明：进行种子配方优化及动物性原料替代后，种子液生物量及发酵产非达霉素水平均有所提高，同时提高了原料安全性及产品质量。

2.4 一级种子培养条件

2.4.1 一级种子生长曲线

一级种子生长曲线见图5。由图5可知：种子培养过程中，0～32 h为延滞期，菌体生长缓慢，pH下降，总糖消耗较慢；32～64 h为对数生长期，菌体快速生长，菌体生物量快速增加，总糖消耗较快，pH由7.23快速上升至7.92；64 h后为稳定期，总糖消耗放缓，生物量及pH维持稳定。一般情况下，对数生长期中后期的种子活性较强，生长繁殖速度快，因此，选择56～64 h为较合适的一级种龄范围。

图5 一级种子生长曲线Fig.5 The growth curve of primary seed

2.4.2 一级种龄对菌体生长及发酵的影响

在菌体生长过程中，不同生长阶段的菌体生理活性差别较大，因此，接种种龄的控制非常重要。根据一级种子生长曲线，将种子分别培养56，58，60，62，64 h后，接入发酵培养基中。种龄对生物量及发酵效价的影响见图6。由图6可知：种龄为56 h时，生物量较低，发酵液效价较低，种龄为62，64 h时，生物量和发酵效价均较高。为了便于人员和设备的合理安排及生产活动的操作便利性，确定一级种子的培养时间为64 h。

图6 种龄对生物量及发酵效价的影响Fig.6 The effect of seed age on biomass and fermentation titer

2.5 二级种子培养条件

在工业化生产过程中，发酵罐的体积越大，所需的种子也越多，因此，需要对种子进行扩大培养。菌种的扩大培养可以为发酵生产提供优良的种子液，保证发酵稳定性并提高发酵产量。因此，二级种子工艺研究对发酵生产意义重大。

2.5.1 二级种子种龄实验

工业化生产中，一级和二级种子的种龄对发酵生产水平影响很大。种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，前期生长缓慢，菌体生物量低，发酵周期延长；种龄过老的种子接入发酵罐后，菌种活性较低导致生产能力衰退；代谢旺盛且成熟的种子液接入发酵培养基中，菌体能快速适应新的发酵培养环境，大大缩短延滞期及发酵产物合成周期，提高生产水平及生产效率[17]。不同的种子培养时间直接影响种子活力，进而影响发酵产抗能力。

实验选取生长56，64 h的一级种子分别接种至二级种子液中，培养不同时间后测定生物量及非达霉素含量，实验结果如表1所示。结果表明：种龄56 h的一级种子液转接至二级种子液，培养48 h后，种子生物量及发酵产非达霉素水平均较高，因此确定生产工艺为一级种子培养56 h，二级种子培养48 h。通过培养基及种子工艺优化，非达霉素产量较原工艺提高了12.3%。

表1 种龄对生物量及发酵效价的影响Table 1 The effect of seed age on biomass and fermentation titer

2.5.2 二级种子种量实验

接种量大小直接影响菌体生长繁殖的速度，进而影响发酵水平[18]。中试放大时，如果一级种子到二级种子的接种量过大，则备种压力较大，同时会增加染菌概率；而接种量过小，则会延长种子培养时间，菌量过低，影响发酵水平。一般而言，二级种子的接种量应控制在0.2%以下，以便于放大生产。

在确定种子配方及接种工艺的基础上，进行二级种子接种量实验。接种量对生物量及发酵效价的影响见图7。由图7可知：二级种子接种量为0.05%时，种子菌量较低，发酵产非达霉素水平较低。当二级种子接种量在0.1%～0.2%之间时，菌体量及发酵水平均无明显差异，因此选择0.1%～0.2%作为二级种子接种量。

图7 接种量对生物量及发酵效价的影响Fig.7 The effect of inoculum size onbiomass and fermentation titer

3 结 论

优质且稳定的种液是微生物发酵制药的关键环节，因此，在选育优良菌种的同时，需要对种子的培养温度、培养基组成和种龄种量进行优化，以提高种液的稳定性及生产能力。用酵母蛋白胨FP102替代了原种子配方中的牛肉膏和蛋白胨两种动物性原料，优化了种子培养温度及种子配方中的碳源和氮源，确定种子最佳培养温度为30 ℃，研究出无动物性原料的新种子配方：玉米淀粉25 g/L，酵母浸出粉5 g/L，多肽粉3 g/L，酵母蛋白胨FP102 5 g/L，碳酸钙4 g/L，pH 7.0。确定一级种子培养条件为30 ℃培养64 h；确定一级种子培养56 h，按0.1%～0.2%的接种量转接二级种子，培养48h后二级种子可达较佳的生理状态，具有较高的生产能力。研究成功替代原配方的动物性原料，避免潜在的病毒污染风险，提升产品安全性及质量标准，并通过优化培养基及种子工艺研究，使非达霉素产量提高了12.3%，为提高发酵产量及发酵稳定性奠定基础。