从线粒体膜稳定作用探讨线粒体K（MITO-KATP）通道开放剂改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制

张海波，李运丽，艾景雪，高瑞，宋志明

一般情况下，缺血再灌注可使心脏器官或组织功能得到恢复；但有时也会导致心脏器官或组织的功能障碍和严重损伤，这种损伤称为心肌缺血再灌注损伤（MIRI）[1,2]。MIRI是临床上常见的病症，多见心脏手术后[3]。其中年龄是其重要影响因素之一[4]。随年龄增长，心脏功能降低是导致MIRI加重的主要原因[5]。线粒体K+ATP（MITOKATP）通道保护心脏的调节位点，线粒体K+ATP通道的开放可缓解大鼠心肌缺血再灌注损伤[6]。尼可地尔是一种线粒体K+ATP通道开放剂，有抗心绞痛的作用，已经在临床上广泛应用[7]。口服尼可地尔可安全有效的治疗中国人的稳定性心绞痛[8]。近年来，尼可地尔因其作为钾离子通道开放剂，被证实有再灌注的保护作用[9]。但其对改善老年冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制尚不清楚。本研究拟从线粒体膜稳定作用，探讨线粒体K+ATP通道开放剂尼可地尔改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂实验动物：健康雄性SD老年大鼠（18～20个月）60只，体重为400～600 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。生长温度为（23±2）℃，环境湿度为45%～50%，光照时间为每天12 h，自由进食、进水，适应性饲养一周。

主要试剂：尼可地尔粉剂购自日本中外株式会社；心肌线粒体提取试剂盒、CK-MB和LDH检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；罗丹明123购自Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒及ECL发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所；线粒体蛋白提取试剂盒购自北京康为生物科技有限公司；p-Cx43抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体和β-actin抗体均购自abcom公司；其余为国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及给药选取30只SPF级健康雄性SD老年大鼠（18～20个月）随机分为3组：假手术（Sham）组、模型（Model）组和尼可地尔（Nic）组，每组20只（动物使用证书号）。建立老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注（MI/R）模型，尼可地尔（Nic）组在再灌注之前，股静脉注射尼可地尔5 mg/kg，假手术组和模型组注射等量的生理盐水。

1.2.2 各组大鼠血清中CK-MB和LDH含量的测定3组大鼠在术后24 h进行腹主动脉取血，在4℃下，3000 rpm离心10 min后，取上清液。血清样本置于-80℃冰箱中保存，采用试剂盒法测定血清样本中CK-MB和LDH水平。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 流式细胞仪测定各组大鼠心肌细胞的线粒体膜电位制备大鼠心肌细胞单细胞悬液。取1×105个细胞，1000 r/min-1离心5 min，PBS洗涤沉淀2次。加入0.5 ml的罗丹明123染色液，充分混匀。将细胞置于37℃培养箱中孵育15 min。孵育结束后，4℃下600×g离心5 min，PBS洗涤沉淀2次。使用500 μl的PBS缓冲液重悬细胞，使用流式细胞仪测定各组大鼠心肌细胞的线粒体膜电位的变化情况。注：每组20只大鼠进行此实验，每个指标重复3次。

1.2.4 Western blot法检测各组大鼠心肌组织及心肌细胞线粒体中的蛋白表达实验结束后，各组大鼠立即进行断头处死。在无菌条件下取各组大鼠的心肌组织，并使用无菌Hank's缓冲液洗涤2次。使用线粒体蛋白提取试剂盒提取小鼠海马组织线粒体蛋白。采用Western blot检测心肌组织线粒体中p-Cx43的蛋白表达水平。同时，提取心肌组织蛋白，采用Western blot检测心肌组织中Bax和Bcl-2的蛋白表达水平。注：每组20只大鼠进行此实验，每个指标重复3次。

使用BCA蛋白浓度试剂盒对蛋白进行定量。选取5%的浓缩胶和10%的分离胶，取20 μl蛋白样品进行上样，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。使用10%的脱脂乳粉溶液封闭2 h后，一抗（1:1000）4℃孵育过夜。使用TBST洗膜三次，每次15 min，二抗（1:4000）室温孵育2 h，用TBST洗膜三次。使用化学发光法对蛋白进行显色。

1.3 统计学处理本研究中数据采用SPSS 20.0统计分析软件（美国IBM公司）处理；计量资料采用“均数±标准差”（±s）表示，先进行正态性检验，若数据呈正态性分布则组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析；P＜0.05代表差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中CK-MB含量的测定如表1所示，与Sham组相比，模型组大鼠血清中CK-MB的含量增加（P＜0.05），说明心肌缺血再灌注会导致心肌细胞损伤；与模型组相比，尼可地尔组大鼠血清中CK-MB的含量下降（P＜0.05），说明尼可地尔有抗心肌缺血的作用。

表1 各组大鼠血清中CK-MB含量的测定（±s）

表1 各组大鼠血清中CK-MB含量的测定（±s）

注：CK-MB：肌酸激酶同工酶；与Sham 组相比，aP＜0.05；与Model组相比，bP＜0.05

组别 例数 CK-MB（U/mg）Sham组 20 84.35±9.05 Model组 20 146.68±14.72a Nic组 20 108.95±12.17b F值 - 29.625 P值 - 0.001

2.2 各组大鼠血清中LDH含量的测定如表2所示，与Sham组相比，模型组大鼠血清中LDH的含量增加（P＜0.05），说明心肌缺血再灌注会导致心肌细胞损伤；与模型组相比，尼可地尔组大鼠血清中LDH的含量下降（P＜0.05），说明尼可地尔有抗心肌缺血的作用。

2.3 各组大鼠心肌细胞线粒体膜电位的变化采用阳离子绿色荧光染料罗丹明123对线粒体的膜电位进行检测，如表3所示，与Sham组相比，模型组大鼠心肌线粒体膜电位降低（P＜0.05），而尼可地尔组大鼠心肌线粒体膜电位高于模型组（P＜0.05），说明心肌细胞凋亡时会导致线粒体膜电位降低以及功能变化，而线粒体K+ATP（MITO-KATP）通道开放剂尼可地尔可缓解线粒体的损伤情况（表4）。

表2 各组大鼠血清中LDH含量的测定（±s）

表2 各组大鼠血清中LDH含量的测定（±s）

注：LDH：乳酸脱氢酶；与Sham 组相比，aP＜0.05；与Model组相比，bP＜0.05

组别 例数 LDH（U/mg）Sham组 20 184.35±12.53 Model组 20 326.52±24.68a Nic组 20 238.68±18.16b F值 - 35.146 P值 - 0.000

表3 各组大鼠心肌细胞线粒体膜电位的变化（±s）

表3 各组大鼠心肌细胞线粒体膜电位的变化（±s）

注：与Sham 组相比，aP＜0.05；与Model组相比，bP＜0.05

组别 例数 线粒体膜电位未降低细胞所占百分比（%）Sham组 20 94.42±5.76 Model组 20 46.74±4.98a Nic组 20 61.49±4.32b F值 - 18.035 P值 - 0.001

2.4 各组大鼠心肌细胞线粒体中p-Cx43、Bax和Bcl-2蛋白的变化Western Blot结果表明，与Sham组相比，模型组大鼠心肌线粒体p-Cx43的蛋白表达下调，而尼可地尔组大鼠心肌线粒体p-Cx43的蛋白表达高于模型组，说明尼可地尔能够上调心肌线粒体p-Cx43的蛋白表达，维持线粒体的稳定性。Western Blot结果表明，与Sham组相比，模型组大鼠心肌组织中Bcl-2的蛋白表达下调；而尼可地尔组大鼠心肌组织中Bcl-2的蛋白表达上调，说明线粒体K+ATP通道开放剂尼可地尔可有效抑制心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡。Western Blot结果表明，与Sham组相比，模型组大鼠心肌组织中Bax蛋白表达上调；而尼可地尔组大鼠心肌组织中Bax蛋白表达下调，说明线粒体K（MITO-KATP）通道开放剂尼可地尔可有效抑制心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡（图1）。

3 结果

图1 大鼠心肌细胞线粒体中p-Cx43、Bax和Bcl-2蛋白的变化

表4 各组大鼠心肌细胞线粒体膜电位的变化（±s）

表4 各组大鼠心肌细胞线粒体膜电位的变化（±s）

注：与Sham 组相比，aP＜0.05；与Model组相比，bP＜0.05

组别 例数 p-Cx43蛋白 Bax蛋白 Bcl-2蛋白Cx43的蛋白 20 1388.03±158.031453.59±203.31367.25±60.86 Model组 20 561.88±138.06a882.63±216.91 1097.38±131.72 Nic组 20 990.81±107.05b1025.75±120.24734.25±140.63 F值 - 18.035 15.369 20.152 P值 - 0.001 0.001 0.001

心肌缺血再灌注损伤常发生于冠状动脉搭桥术、急性心肌梗死溶栓术、体外循环下心脏直视手术等心脏手术后[10]。研究证实心肌线粒体K+ATP开放剂尼可地尔有抗心绞痛的生理功能[11]。研究表明，尼可地尔可以保护缺血后的心肌组织，并使豚鼠心肌细胞的线粒体膜电位发生去极化[12]。推测其心肌保护机制可能与激活心肌细胞线粒体K+ATP，使线粒体膜电位发生去极化有关[13]。因此，本研究通过建立老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注（MI/R）模型，从线粒体膜稳定作用，探讨线粒体K+ATP通道开放剂改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制。当心肌缺血再灌注损伤发生后，机体会产生大量的氧自由基，导致细胞膜发生脂质过氧化反应，加重心肌缺血再灌注损伤程度[14]。研究显示，当心肌梗死发生后，存活的心肌细胞更容易发生缺血再灌注损伤。当心肌缺血再灌注后，机体的血清CK-MB和LDH含量会升高[15]。本研究显示，当老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注后，血清中的CK-MB和LDH含量会升高，而尼可地尔可降低血清中CK-MB和LDH的含量，提示尼可地尔可以减轻心肌缺血再灌注时的过氧化反应，提高心肌组织的抗氧化能力。

线粒体K+ATP激活后，会导致K+内流，膜电位发生去极化，并维持线粒体的能量代谢及体积，抑制细胞凋亡，缓解心肌缺血再灌注损伤[16]。因此，线粒体膜电位的变化与心肌缺血再灌注损伤有着密切的关系[17]。本研究也发现，当老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注后，会导致心肌线粒体膜电位降低，说明心肌细胞凋亡时会导致线粒体膜电位降低以及功能变化。而线粒体K+ATP通道开放剂尼可地尔可使心肌线粒体膜电位升高，提示尼可地尔可以缓解心肌缺血再灌注导致的线粒体损伤情况。

缝隙连接蛋白43（Cx43）不仅在心肌细胞膜中表达，也在线粒体内膜上表达，是哺乳动物心肌的主要缝隙连接蛋白[18]。Cx43有调节线粒体对钾离子通透性的功能[19]。Cx43与线粒体功能的稳定性相关，包括线粒体通透性、线粒体细胞色素c向胞质的释放以及线粒体内钙离子浓度，从而保护心肌组织[20-22]。本研究发现，在老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注后，心肌线粒体中p-Cx43的表达降低，而线粒体K+ATP通道开放剂尼可地尔可上调p-Cx43的表达，提示尼可地尔的心肌保护机制可能与上调心肌细胞线粒体p-Cx43的表达有关。细胞凋亡是受基因调控的生理过程，也是缺血再灌注损伤发生过程中的主要表现[23]。其中，促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2与细胞凋亡密切相关[24]。本研究表明，尼可地尔组大鼠心肌组织中Bcl-2的蛋白表达增强，Bax的蛋白表达减少，提示尼可地尔可能通过抑制心肌细胞的凋亡，从而发挥保护心肌细胞的作用。

综上所述，线粒体K+ATP通道开放剂尼可地尔对心肌缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能是通过降低大鼠血清中CK-MB和LDH的含量，提高心肌细胞线粒体膜电位，上调心肌细胞线粒体p-Cx43蛋白的表达，抑制心肌细胞的凋亡，从而改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注损伤。