佝偻病患儿维生素D受体基因BsmI和FokI位点多态性与骨密度相关性研究

王道静，吕为萍，李建友，厉吉霞

维生素D缺乏性佝偻病(vitamin D deficient rickets)是由于婴儿体内维生素D不足，造成钙、磷代谢紊乱、骨盐沉积量减少、骨形成障碍，形成一种以骨骼病变为特征的全身慢性营养性疾病[1]，甚至造成成人后骨质疏松的发生。研究发现,即使在阳光充足的地域，佝偻病的发病率也比较高，且给予患儿补充维生素D之后的效果也不尽相同，说明佝偻病的发生不仅与环境和营养因素有关，还与基因遗传因素有关[2]。维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)作为核内生物大分子，在机体内发挥着极其重要的作用，尤其是维持钙磷代谢等[3]。近年来，VDR基因被认为是遗传调控骨和钙代谢的候选基因[4]。研究表明，VDR等位基因通过影响信使RNA的表达，进而引起其受体蛋白在数量或功能上的差异，进一步地引起对钙磷代谢调节出现异常，最终影响机体肠道中对钙磷的吸收，使骨骼中的钙磷沉积发生改变，从而影响骨密度(BMD)[5]。因此本研究采用病例对照研究方法，选取山东省烟台地区的婴幼儿作为研究对象，分析VDR基因 BsmI和FokI位点多态性与佝偻病、骨密度相关性，以期对本地区佝偻病患儿提供辅助性病因诊断，预测维生素D治疗效果，指导临床维生素D个体化用量。进而降低佝偻病患儿低骨密度对骨骼造成的不可逆性的改变，避免成人期骨质疏松的发生，报道如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取2017年1—12月于烟台市烟台山医院儿科就诊的佝偻病患儿作为研究对象，纳入标准：(1)符合中华医学会儿科学分会儿童保健学组制定的“维生素D缺乏及维生素D缺乏性佝偻病防治建议”诊断标准[6]；(2)临床表现为枕秃、肋软骨沟、鸡胸。排除标准：(1)长期服用激素类药物；(2)伴随先天性疾病；(3)早产儿；(4)伴随遗传性疾病及肝肾功能障碍的患儿。最终纳入符合要求的患儿50例作为研究组，男30例，女20例，年龄4～12(7.89±1.23)个月。另选择同期在医院体检的健康婴儿50例作为健康对照组，男29例，女21例，年龄4～12(7.92±1.21)个月。2组婴儿均不存在影响维生素D吸收的胃肠道、内分泌、肝肾疾病等。2组婴儿性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，所有入选婴儿的监护人均知情同意并签署知情同意书。

1.2 观察指标与方法

1.2.1 VDR基因BsmI和FokI位点多态性分析：采用口腔拭子采集婴儿口腔上皮细胞，然后采用DNA试剂盒进行提取，并采用紫外分光光度计测量纯度和含量，PCR引物采用Primer Premier 6.23 DEMO软件进行设计，由上海吉玛生物有限公司代为合成。BsmI：F.3'-CCCTCACTGCCCTTAGCTC-5',R.3'-CCTCCAAAATCAATCAGGTAAAC-5'；FokI：F.3'-GCTGAGCTCCCTGGTGGT-5'，R.3'-AGCATTGAAGTGAAAGCCAGT-5'。反应条件：总体系为50 μl，95℃预变性3 min，之后94℃变形30 s、55℃退火35 s、72℃延伸40 s，35个循环后，再72℃延伸5 min。1%琼脂糖电泳，嗅化乙啶染色，然后采用PCR纯化试剂盒进行纯化，采用3730XL基因测序仪(美国ABI公司生产)完成基因分型。

1.2.2 骨密度检测：采用BMD-1000A超声波骨密度仪(上海名元实业有限公司)检测左胫骨中段骨密度，然后通过数据库自动计算骨密度Z值，骨密度检测由2位具有5年以上工作经验的医师完成。

1.2.3 生化指标检测：常规禁食8 h，采集肘静脉血1.5 ml，离心5 min，收集血清，一部分采用全自动生化分析仪检测血清钙和磷；另一部分采用酶联免疫试剂盒(基尔顿生物科技有限公司)检测25-(OH)D3水平，采用全血干化学法检测骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,B-ALP)，试剂盒购自安徽高山药业有限公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件对数据分析。采用卡方检验判断各位点基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；计数资料用频数或率(%)表示，组间比较采用χ2检验；符合正态分布计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验；不同基因型的骨密度、血钙、血磷以及25-(OH)D3采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；Logistic单因素回归分析基因位点与佝偻病发病的风险性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组婴儿血钙、血磷、骨密度、B-ALP及25-(OH)D3水平比较 研究组患儿血钙、骨密度以及25-(OH)D3明显低于健康对照组，而血磷和B-ALP明显高于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 Hardy-Weinberg平衡检验结果显示BsmI位点(χ2=0.714，P>0.05)和FokI位点(χ2=0.693，P>0.05)，均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明选取的对象具有代表性。

2.3 2组婴儿VDR基因BsmI和FokI位点基因多态性分布比较 研究组和健康对照组在FokI位点上的基因型ff、Ff及FF分布上差异有统计学意义(P<0.05)，而在BsmI位点上基因型BB和Bb+bb分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4 2组婴儿VDR基因BsmI和FokI位点基因多态性与佝偻病风险性的关系 校正性别和年龄后，结果显示FokI位点携带FF基因型个体的佝偻病发生风险是携带Ff+ff基因型个体的3.918倍，差异具有统计学意义(OR=3.918，95%CI1.174～8.918，P=0.045)，而BsmI位点基因型BB与bb+Bb个体相比，佝偻病发病差异无统计学意义(OR=1.034，95%CI0.437～1.562，P=0.782)。

2.5 2组婴儿VDR基因FokI位点不同基因型血钙、血磷、骨密度、B-ALP及25-(OH)D3比较 2组骨密度和25-(OH)D3在不同基因型间差异均具有统计学意义(P<0.05)，而不同基因型间血钙、血磷以及B-ALP间差异无统计学意义(P>0.05)。两两比较结果显示FF基因型个体骨密度和25-(OH)D3水平均明显低于携带Ff和ff基因型个体(P<0.05)，见表3。

3 讨 论

据报道，中国北方地区佝偻病的流行率为40%左右[7]。人体大部分骨矿含量的累积发生在婴儿及青少年时期，至30岁左右达到骨量峰值(peak bone mass，PBM)。PBM代表个体一生中所能达到的最大BMD值，PBM的高低与原发性骨质疏松症发生密切相关[8]。婴幼儿作为佝偻病的高发群体，虽不会给患儿生命安全造成威胁，但会引起患儿抵抗力下降，致使其容易发生腹泻、贫血等疾病，因此正确识别和诊断佝偻病至关重要[9]。B-ALP作为骨合成过程中的关键酶，由成骨细胞合成分泌，如果小儿体内缺乏维生素D，骨钙化不足，成骨细胞就会活跃，B-ALP活性就会升高[10]。本研究结果显示佝偻病患儿血钙、骨密度以及25-(OH)D3明显低于健康对照组，而血磷和B-ALP明显高于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。提示血钙、骨密度、25-(OH)D3、血磷和B-ALP均可作为诊断佝偻病的生化指标。

表1 2组婴儿血钙、血磷、骨密度、B-ALP及25-(OH)D3水平比较

表2 2组婴儿VDR基因BsmI和FokI位点基因多态性分布比较 (例)

表3 2组婴儿VDR基因FokI位点不同基因型血钙、磷、骨密度、B-ALP以及25-(OH)D3比较

注：组内与ff基因型比较，aP<0.05；组内与Ff基因型比较，bP<0.05

婴儿时期的PBM与性别、钙吸收、运动、体质以及遗传等诸多因素有关。文献报道称即使在阳光充足的地域，佝偻病的发病率也比较高，且给予患儿补充维生素D之后的效果也不尽相同，说明佝偻病的发生不仅与环境和营养因素有关，还与基因遗传因素有关[11]。维生素D与骨代谢有着非常密切的关系。人体内维生素D主要活性形式是25-(OH)D3，它通过对肠、肾、骨等靶器官的作用发挥其抗佝偻病的生理功能[12]。维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)作为核内生物大分子，属于一种配体依赖的核转录因子，通过与其他激素如甲状旁腺激素共同维持钙、磷的动态平衡，调节骨骼代谢[13]。近年来，研究发现维生素D受体基因是调控骨和钙代谢的候选基因[14]。本研究结果显示烟台地区婴幼儿VDR基因FokI位点基因多态性和佝偻病风险性相关，携带FF基因型个体的佝偻病发生风险是携带Ff+ff基因型个体的3.918倍，说明FokI位点FF基因更容易发生佝偻病。

与骨代谢相关的VDR基因FokI位点在VDR基因5'端第二个外显子转录起始位点，当由ATG突变为ACG时，原本由从第一位起始密码子ATG转录(f型VDR基因)，转变成从下游存在ATG开始转录(F型VDR基因)[5]。因此，F位点的VDR所表达出来的蛋白质长度要短于f位点，因此其亲和力、稳定性及转运活力要比f位点高，所以F位点的VDR所表达出来的蛋白质能够增加肠道对钙的吸收，从而增加BMD。FokI位点基因多态性可能主要是通过影响钙和维生素D的摄入，从而引起佝偻病的发生[16]。另外本研究还对比了佝偻病婴儿和健康婴儿不同基因型个体血钙、血磷、骨密度、B-ALP以及25-(OH)D3的差异，结果显示FokI位点FF基因型个体骨密度和25-(OH)D3水平均明显低于携带Ff和ff基因型个体(P<0.05)，说明FokI位点基因多态会影响到骨代谢，从而引起佝偻病发生。而对于BsmI位点多态性，本研究尚未发现其与佝偻病风险性相关，研究结果与银川地区婴儿BsmI位点多态性分布差异无统计学意义一致[17]。可能是因为BsmI位点在VDR内含子中，因此并不改变VDR蛋白的序列。

综上所述，烟台婴幼儿FokI位点基因多态性和骨密度、25-(OH)D3水平密切相关，FF基因型可能是佝偻病发生的遗传危险因素，提示佝偻病发生不仅与维生素D缺乏和紫外照射不足有关，还与基因异常突变有关，通过对婴儿VDR基因检测，从遗传角度进行评估，明确个体对维生素D需求的差异，从而采取个性化干预方案，有利于针对性地指导婴儿对维生素D和钙的摄入，从而降低佝偻病发生率。

利益冲突：无

作者贡献声明

王道静、吕为萍：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写,提出研究思路，分析试验数据，论文审核;李建友、厉吉霞：实施研究过程，资料搜集整理