磷酸肌酸钠通过miR-25-3p/肌浆网Ca2+泵-2a信号通路改善多柔比星诱导大鼠心肌损伤

张雪洁，尧 青，胡 玲，柯志强，张 波，3，孟祥雯，杨晓松

（湖北科技学院1.药学院，2.糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100；3.三峡大学第二人民医院，湖北 宜昌 44300）

临床上常单独使用多柔比星（doxorubicin，DOX）或与其他抗肿瘤药物联合用于治疗实体肿瘤、淋巴瘤和儿童白血病[1]，但因其严重的心脏毒性限制其在临床的应用[2]。研究结果显示，DOX心脏毒性主要因其介导活性氧自由基（reactive oxygene species，ROS）大量产生引起心肌组织脂质过氧化，而抗氧化活性的下降，最终导致氧化应激和细胞凋亡[3]。此外，DOX还能刺激心肌细胞线粒体和肌浆网释放Ca2+从而加剧胞浆内Ca2+超载[4]。肌浆网 Ca2+泵-2a（sarco/endoplasmic reticulumCa2+ATPase，SERCA2a）是分布在哺乳动物心肌中的重要Ca2+泵，在心动周期中控制Ca2+的输运，通过水解ATP获得的化学能源输运Ca2+进入肌浆网内[5]。SERCA2a通过维持Ca2+平衡确保心肌细胞的正常生理活动。当心肌细胞内肌浆网Ca2+吸收不够，将会导致心肌细胞收缩，可用的Ca2+减少，最终导致心脏收缩和舒张功能出现障碍[6]。已有研究表明，DOX在心肌细胞中产生的H2O2会抑制SERCA2a的mRNA转录和蛋白表达，SERCA2a摄取Ca2+的能力显著下降[7]。因此，SERCA2a在DOX心脏毒性中发挥重要调控作用，具体调控机制还不清楚。

微RNA（microRNA，miRNA，miR）作为基因表达的重要调节物，通过与目的基因mRNA的3’UTR区域结合，在转录后或翻译水平抑制基因表达，在许多生理及疾病的发生发展过程中发挥重要作用[8]。在多种心血管疾病如心律失常、左心室肥厚和重构中[9]都可检测到miR-25的异常表达，如在心力衰竭的心肌组织中miR-25高表达，抑制miR-25的表达可增强心脏收缩力从而改善心力衰竭[10]。据报道，在主动脉缩窄术诱导小鼠心衰模型中，miR-25靶向SERCA2a mRNA3′UTR，抑制SERCA2a的表达，是主动脉弓缩窄（transverse aortic constricition，TAC）诱导心衰的重要因素[11]。也有研究认为，miR-25在离体心肌细胞延迟Ca2+的摄取，抑制miR-25表达可以提高SERCA2a表达水平，从而达到改善心脏功能的目的[12]。

磷酸肌酸钠（creatine phosphate sodium，CP）是一种小分子高能磷酸化合物，也是心肌细胞最主要和最直接的功能物质，可快速进入细胞并在短时间内即达到有效浓度。具有保护细胞结构，稳定心肌细胞电生理平衡的功能[13]，在临床上作为心肌保护药物，主要用于治疗心力衰竭和心肌梗死等的治疗药物[14-15]，近年来也在临床上用于DOX所致心肌损伤的保护药物[16]，但其保护机制目前还不清楚。本研究采用DOX诱导SD大鼠心肌损伤以及诱导心肌细胞H9C2损伤作为体内外模型，采用CP进行干预，评价CP对DOX所致心肌损伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和主要仪器

DOX粉末和CP（美国Sigma公司）；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cystine，NAC）（中国Meilunbio公司）；DMEM培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Gibco公司）；HE染色试剂盒和Masson三色染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Trizol试剂（美国Ambion公司）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL Apoptosis Detection Kit FITC）（上海翊圣生物科技有限公司）；RT-PCR试剂盒（日本Takara公司）；细胞裂解液、蛋白酶抑制剂（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、BCA蛋白定量/浓度测定试剂盒（中国Meilunbio公司）；化学发光（electro-chemilumines-cence，ECL）显影液，蛋白酶抑制剂（protease inhibitor cocktail）（美国Thermo Fisher公司）；兔抗人SERCA2a多克隆抗体（中国ABclonal公司），小鼠抗人超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）单抗（美国Abcam公司），兔抗人活化的胱天蛋白酶3多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG抗体（二抗）（美国Biosharp公司）。

1.2 动物和DOX诱导大鼠心肌损伤模型制备

40只SD雄性大鼠，实验动物合格证号：SCXK（京）2016-0011，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。SD大鼠随机分为3组，以下给药均为隔天1次（给药持续26 d）。正常对照组（n=10），ip给予生理盐水 5 mL·kg-1；DOX组（n=15），前3次ip给予生理盐水5 mL·kg-1，之后ip给予生理盐水30 min后，再ip给予DOX 2 mg·kg-1，共给药7次；CP+DOX组（n=15），前3次ip给予CP 200 mg·kg-1，之后ip给予CP 200 mg·kg-130 min后，再ip给予DOX 2 mg·kg-1，共7次，之后ip给予CP 200 mg·kg-13次，停药后继续喂养7周，处死大鼠取心肌组织-80℃冰箱保存备用。

1.3 HE染色观察大鼠心肌组织病理变化

固定后的心脏组织按照常规方法进行组织脱水、透明、浸蜡、包埋以及切片。之后将石蜡切片放入二甲苯中脱蜡10 min，经100%～70%梯度乙醇浸泡5 min，使用PBS冲洗5 min，滴加50 μL苏木精染色15 min后用自来水冲洗，滴加1%盐酸乙醇分化数秒后，使用1%氨水返蓝1 min，自来水冲洗，接着滴加50 μL伊红染色5 min，在80%～95%梯度乙醇中快洗，100%乙醇浸泡10 min（处理2次），二甲苯透明10 min（处理2次），中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.4 Masson染色检测心肌组织胶原纤维沉积

将心尖组织切片脱蜡后放在二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，再分别用95%，90%，80%，70%乙醇浸泡5 min，之后滴加Bouin液在湿盒中过夜，第2天流水冲洗至黄色消失，天青石蓝染色液滴染2～3 min后稍水洗，之后用Mayer苏木素染色液滴染2～3 min后水洗，酸性乙醇分化液分化约10 s，接着流水冲洗10 min，丽春红品红染色液滴染2 min，蒸馏水冲洗；磷钼酸溶液处理约10 min，倾去上液，直接滴入苯胺蓝染色液染6 min，0.1%～0.3%冰醋酸溶液处理约30 s，100%乙醇脱水2 min，二甲苯透明10 min，吹干后用中性树胶封片，显微镜下观察胶原累积。

1.5 TUNEL染色法检测大鼠心肌组织细胞凋亡

石蜡组织切片常规脱蜡至水，用PBS轻轻润洗切片并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体；每个样本上滴加100 μL蛋白激酶K工作液，室温孵育20 min；滴加100 μL 1× Equilibration 缓冲液室温孵育10～30 min，加入50 μL TdT孵育缓冲液37℃孵育60 min，用PBS洗5 min，共2次；在暗室中将载玻片浸入DAB溶液中，室温孵育5 min，用H2O终止反应；封片，在普通光学显微镜下观察拍照。采用Image Pro软件对图片结果进行分析，选取阳性染色部位光密度（intensity absorbance，IA）值与图片的面积之比即为平均光密度值，以此值来半定量细胞凋亡。

1.6 H9C2心肌细胞培养和分组

大鼠心肌细胞系H9C2（上海复旦IBS细胞资源中心）；H9C2细胞在37℃5%CO2条件下培养于含10%FBS及1%青、链霉素混合液（100×）的DMEM培养基中，细胞融合度为80%～90%时传代。将处于对数生长期的H9C2细胞种于6孔细胞培养板内，培养24 h后给药。分组① DOX 1 μmol·L-1处理心肌细胞H9C2不同时间（0，3，6，12和24 h），收集细胞。分组② 细胞分为5组：细胞对照组（0.1%DMSO），DOX 1 μmol·L-1组，CP 1 mmol·L-1组，CP 1 mmol·L-1+DOX 1 μmol·L-1组，NAC 0.5 mmol·L-1+DOX 1 μmol·L-1组，处理24 h后收集细胞。

1.7 CCK8检测H9C2心肌细胞存活率

取1.6分组②前4组的细胞，置37℃CO2培养箱培养24 h后，每孔加入10 μL CCK8试剂，然后置培养箱中继续培养2 h后，采用酶标仪测定450 nm处的吸光值（A450nm）。细胞存活率（%）=（实验组A450nm-空白孔A450nm）/（细胞对照组A450nm-空白孔A450nm）×100%。

1.8 荧光定量PCR检测大鼠心肌组织和H9C2心肌细胞中miR-25-3p的表达

取1.2分组大鼠心肌组织0.2～0.4 μg，加入1 mL Trizol，采用电动匀浆机将组织磨碎，然后加入1/5体积的氯仿，涡旋振荡混匀后静置10 min，4℃条件下12 000×g离心5 min，将上清转移至另一离心管内，加入等体积异丙醇，涡旋振荡后静置10 min，12 000×g，4℃条件下离心10 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，12 000×g，4℃条件下离心5 min，吸干乙醇，通风橱内吹干，加入适量无RNA酶无菌水溶解沉淀，超微量核酸分光光度计测定RNA浓度及纯度，-20℃保存以备后续荧光定量分析。1.6分组①和分组②的细胞采用Trizol裂解H9C2细胞，后续总RNA提取同上；以抽提的总RNA作为模板，采用茎环引物rno-miR-25-SLP合成cDNA，再以cDNA为模板，SYBR Green I作为荧光染料，U6作为内参，rno-miR-25-3p和UDP作为正反引物检测miR-25-3p的表达水平，用2-△△Ct法计算待测基因的相对表达。引物序列见表1。

1.9 Western印迹法检测大鼠心肌组织和H9C2心肌细胞SOD2、SERCA2a和活化的胱天蛋白酶3蛋白表达

取1.2分组大鼠心肌组织，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA，冰浴条件下采用电动匀浆机打碎组织，冰浴10～20 min，4℃条件下以12 000×g，离心10 min，将上清转移至另一干净离心管，采用BCA法测定蛋白浓度；1.6分组②前4组细胞加入含蛋白酶抑制剂的RIPA，充分裂解细胞，后续蛋白抽提方法同上；SDS-PAGE蛋白电泳分别采用4%的浓缩胶和10%的分离胶，上样量为25 μg总蛋白，电泳结束后转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，然后更换为一抗（1∶1000）溶液于4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min，二抗（1∶5000）溶液室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL显影液显影，经Bio-Rad凝胶成像系统进行图像采集，Image J软件进行半定量分析，用目的蛋白条带和内参蛋白条带IA值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

Tab.1 Sequence of primers for RT-PCR

1.10 统计学分析

实验结果数据采用±s表示。采用GraPhPad Prism 5 Project软件进行数据分析，用单因素方差分析和t检验进行分析处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 磷酸肌酸钠对多柔比星诱导大鼠心肌组织病理损伤的影响

大鼠心肌组织HE和Masson染色结果（图1）所示，DOX组心肌组织肌纤维排列紊乱，甚至部分肌原纤维溶解、断裂，胶原纤维增多；相对于DOX组，CP+DOX组心肌组织肌纤维排列较为整齐，肌纤维较完整，胶原沉积量减少，心肌组织病理病变得到改善。

Fig.1 Effect of creatine phosphate sodium（CP）on pathological changes in myocardial tissues of rats with myocardial injury induced by doxorubicin（DOX）.Rats were ip injected with normal saline（5 mL·kg-1）or DOX（2 mg·kg-1），or CP（200 mg·kg-1）+DOX once every other day，for 7 times，and then were fed for another 7 d after the last injection.Arrows show the collagen accumulation in rat myocardial tissue.

2.2 磷酸肌酸钠对多柔比星诱导大鼠心肌组织细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果（图2）所示，与正常对照组比较，DOX组心肌组织的棕黄色阳性细胞核增多，约为正常对照组的4倍（P＜0.05）；CP+DOX组阳性染色细胞核明显少于模型组，约为DOX组的1/2（P＜0.05），表明CP能够减轻DOX诱导的心肌细胞凋亡。

Fig.2 Effect of CP on apoptotic rate of myocardiocytes of rats with myocardial injury induced by DOX（TUNEL staining）.See Fig.1 for the rat treatment.Arrows show apoptosis cells in the rat myocardial tissues.B：semi-quantitative result of A.IA：intensity absorbance.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

2.3 磷酸肌酸钠对多柔比星诱导大鼠心肌和H9C2细胞miR-25-3p mRNA表达的影响

荧光定量PCR法检测结果（表2）显示，与正常对照组比较，DOX组大鼠心肌组织中miR-25-3p表达上升了4.57倍（P＜0.05），而CP+DOX组miR-25-3p表达水平相对DOX组下降77.3%（P＜0.05），基本恢复到正常对照组的水平。

Tab.2 Effect of CP on miR-25-3p mRNA in myocardial tissue of rats with myocardial injury induced by DOX

荧光定量PCR分析结果（图3A）显示，H9C2细胞miR-25-3p表达水平随着DOX刺激时间的延长而持续升高，呈时间依赖性上调（r=0.9681，P＜0.05）。与 DOX 1 μmol·L-1组比较，NAC+DOX 组和CP+DOX组miR-25-3p表达水平均显著下调（P＜0.05）（图3B）。

Fig.3 Effect of CP or N-acetylcysteine（NAC）on miR-25-3p mRNA expression in H9C2 cells induced by DOX by quantitative real-time PCR（qRT-PCR）.A：H9C2 cells were treated with DOX 1 μmol·L-1for 0，3，6，12 and 24 h.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group（0 h）.B：H9C2 cells were pretreated with CP 1 mmol·L-1or NAC 0.5 mmol·L-1 for 1 h，then DOX 1 μmol·L-1for 24 h.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

2.4 磷酸肌酸钠对多柔比星诱导H9C2心肌细胞活力的影响

CCK8检测结果（图4）显示，DOX 1 μmol·L-1组H9C2细胞存活率显著降低（P＜0.05）；与DOX组相比，CP+DOX组细胞存活率升高（P＜0.05），表明CP 1 mmol·L-1能够明显改善DOX对H9C2细胞存活的抑制作用。

Fig.4 Effect of CP on H9C2 cell viability incluced by DOX.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

2.5 磷酸肌酸钠对多柔比星诱导大鼠心肌组织和H9C2细胞SOD2、SERCA2a和活化的胱天蛋白酶3蛋白表达水平的影响

Western印迹法检测结果（图5A和B）显示，与正常对照组比，DOX组SOD2和SERCA2a蛋白表达水平分别下降了约30%和20%（P＜0.05），而活化胱天蛋白酶3蛋白上升了约50%；与DOX组比较，CP+DOX组SOD2和SERCA2a蛋白表达上调（P＜0.05），显著降低了活化的胱天蛋白酶3蛋白表达水平。

Fig.5 Effect of CP on protein expressions of superoxide dismutase 2（SOD2），sarco/endoplasmic reticulum-Ca2+ATPase（SERCA2a）and cleaved-caspase 3 in rats with myocardial injury induced by DOX by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B：semi-quantitaive results of A.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

Western印迹结果（图6A和B）显示，DOX刺激H9C2细胞3 h，SERCA2a蛋白表达上升，随后开始下降，直至24 h，其表达水平远低于0 h；而活化的胱天蛋白酶3蛋白表达水平呈时间依赖性上升（r=0.8124，P＜0.05）。当CP 1 mmol·L-1预处理H9C2细胞1 h后，再加生理盐水或DOX 1 μmol·L-1继续处理24 h，结果如图（图6C和D所示），与细胞对照组相比，CP组SOD2，SERCA2a和活化的胱天蛋白酶3蛋白表达均无明显变化；与DOX组比较，CP+DOX组SOD2和SERCA2a蛋白表达上调（P＜0.05），而活化的胱天蛋白酶3蛋白表达下调（P＜0.05）。

Fig.6 Effect of CP on protein expressions of SOD2，SERCA2a and cleaved-caspase 3 in H9C2 cells induced by DOX by Western blotting.See Fig.4 for the cell treatment.B：semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with 0 h.D：semi-quantitative result of C.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with DOX group.

3 讨论

本研究结果显示，CP在一定程度上改善DOX所致大鼠心肌组织肌原纤维紊乱，减少胶原蛋白的累积和心肌组织细胞凋亡；另一方面，DOX减弱心肌组织抗氧化活性蛋白SOD2和涉及Ca2+动态平衡调控的SERCA2a蛋白的表达，上调凋亡信号活化胱天蛋白酶3蛋白和miR-25-3p表达。CP的干预部分缓解DOX诱导SOD2和SERCA2a的表达下调，降低活化的胱天蛋白酶3蛋白和miR-25-3p的表达水平。以上结果表明，CP的干预改善DOX诱导的氧化应激和细胞凋亡，同时miR-25-3p/SERCA2a信号通路发生相应的变化。由此，CP缓解DOX诱导的大鼠心肌损伤，可能机制涉及CP对DOX诱导miR-25-3p/SERCA2a信号通路的抑制，改善心肌细胞内Ca2+动态平衡，减少心肌细胞凋亡。

DOX处理H9C2细胞3 h，miR-25-3p的表达水平无变化，从第6 h开始，miR-25-3p的表达水平呈时间依赖性上升；miR-25-3p靶基因SERCA2a的表达水平在DOX刺激3 h时急剧增加，随后随着时间的延长而逐渐下降，24 h的表达水平要远低于0 h，在最初3 h的急剧增加可能是细胞应激反应，起到自我保护的作用，随后SERCA2a受到miR-25-3p的干扰而表达水平逐渐下降；CP预处理1 h后再给予DOX刺激H9C2 24 h，结果同动物实验结果一致，CP改善DOX诱导SOD2和SERCA2a蛋白表达下调，抑制活化的胱天蛋白酶3蛋白和miR-25-3p表达增加；我们之前报道NAC的干预减轻DOX诱导的氧化应激[17]。本研究CCK8实验结果表明，NAC和CP都能显著改善DOX的心肌细胞毒性作用。以上结果说明，CP具有较好的抗氧化活性的同时，可能通过抗氧化作用来抑制DOX诱导miR-25-3p/SERCA2a信号通路的活性，改善心肌细胞内Ca2+动态平衡，减轻DOX的心肌毒性。

DOX所致心肌损伤的机制主要涉及β肾上腺素受体途径、细胞内Ca2+途径和氧化应激介导的细胞凋亡，SERCA2a的表达上调能够减轻DOX心肌毒性[18-19]。CP在临床上应用于心脏手术或癌症患者化疗前的心脏保护作用，但其作用机制并不明确。本研究体内外实验结果表明，CP具有较好的抗氧化活性，并显著改善DOX心脏毒性。深入研究发现，CP抑制DOX诱导miR-25-3p表达上调，SERCA2a的表达下调。综上所述，CP有可能通过调控miR-25-3p/SERCA2a信号通路改善细胞内Ca2+动态平衡，减轻DOX诱导的心脏毒性，揭示了CP改善DOX心脏毒性的可能调控机制，为临床预防和改善DOX的心脏毒性提供一定的理论基础和研究思路。